Stable：                                                     100μl/支

pUC19 (control vector，10pg/μl):                   10μl

保存條件(保質期)：                            -80℃（6個月）

基因型

F' proA+B+ lacI^q ?(lacZ)M15 zzf::Tn10 (Tet^R) ?(ara-leu) 7697 araD139 fhuA ?lacX74 galK16 galE15 e14- Φ80dlacZ?M15 recA1 relA1 endA1 nupG rpsL (Str^R) rph spoT1 ?(mrr-hsdRMS -mcrBC) 

產品說明

Stable菌株是NEB公司開發的高轉化效率菌株，是逆轉錄病毒/慢病毒載體系統推薦使用的菌株，特別適合慢病毒或具有末端重復序列DN段的克隆。基因組含有重組酶recA1 rel A1突變，可有效抑制長片段末端重復區的重組，降低錯誤重組的概率；同時含有核酸酶endA1突變，避免了提取質粒過程中核酸酶的污染，大大提高了高純度病毒質粒的產量和質量。lacZΔM15的存在使Stable可用于藍、白斑篩選，此菌株具有四環素和鏈霉素抗性，Stable感受態細胞經特殊工藝制作，pUC19檢測轉化效率>5×10⁸ cfu/μg DNA。 

操作方法

1. Stable感受態細胞從-80℃拿出，迅速插入冰中，6分鐘后待菌塊融化，加入目的DNA（質粒或連接產物）并用手打EP管底輕輕混勻(避免用槍吸打)，冰中靜置25分鐘。

2. 42℃水浴熱激45秒，迅速放回冰上并靜置5分鐘，晃動會降低轉化效率。

3. 向離心管中加入0.9 mL室溫S.O.C.或LB培養基(S.O.C.營養豐富，可提高轉化效率)。

4. 30℃，250 rpm復蘇60分鐘。

           當質粒中含有不穩定片段時，30℃培養可降低錯誤重組的概率，若轉化control pUC19計算轉化效率

           則需37℃，225 rpm復蘇60分鐘

5. 篩選平板提前拿出放30℃孵育使平板溫度保持30℃，吸取50-100 μl直接涂篩選平板或5000 rpm離心一分鐘收菌，留取100 μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊并涂布到含相應抗生素的S.O.C.或LB培養基上。

6. 將平板倒置放于30℃培養20-24小時或37℃過夜培養。

當質粒中含有不穩定片段時，30℃培養可降低錯誤重組的概率，若轉化control pUC19計算轉化效率，

則需37℃培養過夜

注意事項

1. 對不穩定DN片段的克隆或逆轉錄病毒/慢病毒載體的構建，涂板后平板應在30℃培養，以減少發生錯誤重組的概率

2. 制備高純度病毒質粒時，應使用新鮮轉化的平板接菌，新鮮菌液提取質粒，菌液不可低溫保存后使用。

3. 對不穩定的克隆或病毒質粒優先以質粒狀態保存，盡量避免將質粒保存在大腸桿菌細胞中。

4. 感受態細胞好在冰中緩慢融化。插入冰中10分鐘內加入目標DNA，不可在冰中放置時間過長，長時間存放會降低轉化效率。混入目的DNA時應輕柔操作。

5. 轉化高濃度的質粒或高效率的連接產物可相應減少終用于涂板的菌量。