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常規(guī)普通PCR常見問題
閱讀：2319 發(fā)布時間：2022-7-4
1.瓊脂糖凝膠電泳后無PCR擴增產(chǎn)物條帶
主要表現(xiàn)：Marker及對照條帶均正常，但檢測樣本無條帶。
原因分析：1.反應(yīng)條件不合適：PCR過程中退火溫度過高，退火延伸時間不足，反應(yīng)循環(huán)數(shù)過少。
2.核酸模板濃度或純度低：普通PCR的檢測敏感度有限，樣本核酸含量低或者含有抑制物。
3.反應(yīng)體系與核酸擴增不匹配：檢測體系中的Mg2+濃度，dNTPs量或Buffer與目標核酸擴增所需條件不匹配。
4.引物設(shè)計不當或者發(fā)生降解：存在引物二聚體或二級結(jié)構(gòu)，引物稀釋后未分裝儲存條件不適宜或者反復(fù)凍融次數(shù)過多。
解決方案：1.優(yōu)化反應(yīng)條件，梯度摸索退火溫度，延長退火延伸時間，增加反應(yīng)循環(huán)數(shù)（30-45區(qū)間為宜）。
2.對核酸模板進行純化，或使用商業(yè)化核酸提取試劑盒進行提取，增加核酸模板的上樣量。
3.優(yōu)化反應(yīng)體系（預(yù)混體系除外），改變檢測體系中的Mg2+濃度及dNTPs用量，更換體系中Buffer。
4.重新設(shè)計引物，避免引物二聚體和鏈內(nèi)二級結(jié)構(gòu)，在一次稀釋引物后可分裝成多支小管，減少反復(fù)凍融次數(shù)。