質粒表達載體注意事項：轉化前請準確查找該質粒相應的抗生素名稱、抗生素使用濃度、感受態名稱和培養溫度。
1、收到質粒干粉后請先5000rpm離心1min，再加入20μl~50μl無菌水或 pH8.0 的 1*TE緩沖液來溶解質粒，室溫放置1min；

2、從-80℃冰箱中取出相應的感受態，置于冰盒上解凍，并做好標記；

3、取2μl質粒加至100μl感受態中，冰浴30min；

4、42℃熱激90s，再冰浴2min；

5、加入900μl無抗的LB液體培養基，180rpm震蕩培養45min；

6、6000rpm離心5min，僅留100ul上清混勻菌體沉淀；

7、混勻后的菌液加至對應抗性的LB平板上，倒入適量玻璃珠，涂勻液體；

8、將平板正向培養1h，再倒置培養12h~16h；

9、挑取單克隆菌落至對應抗性的LB液體培養基中，震蕩培養12h~16h，根據實驗需要提取質粒

　　目前，載體主要有非病毒和病毒兩大類。非病毒載體可以實現基因的順式中表達，周期較短，操作簡單。病毒載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而達到持久性表達目的序列的效果。對于一些較難轉染的細胞，如原代細胞、干細胞、不分化的細胞等，使用慢病毒載體，能大大提高目的基因的轉導效率，能夠比較方便快捷地實現目的基因的長期、穩定表達。

　　可以根據您的需要創造新的基因（質粒構建），表達后可擁有新的蛋白質，即通常說的重組蛋白或融合蛋白（質粒表達）。我舉個例子，加入蛋白質ABC和DEFG分別由三個結構域和四個結構域組成，而你需要分子量小且具有第一個蛋白A結構域的功能和第二個蛋白中G結構域的功能，那么你可將AG基因克隆，裝入載體后進行表達，這樣產生了新蛋白AG。當然這只是理論上，新蛋白表達后是否能夠具有原來AG的功能，能否表達出來，表達量高低等等都是你所要考慮的問題。

　　一、載體的選擇及如何閱讀質粒圖譜

　　目前，載體兩大類,其中質粒DNA是一種新的非病

　　毒轉基因載體。

　　一個合格質粒的組成要素:

　　(1）復制起始位點Ori即控制復制起始的位點。原核生物DNA 分子中只有一個復制起始點。而

　　真核生物DNA分子有多個復制起始位點。

　　(2）抗生素抗性基因可以便于加以檢測，如 Amp+ ,Kan+(3）多克隆位點MCS克隆攜帶外源基因片段

　　(4)P/E啟動子/增強子

　　(5 )Terms終止信號

　　(6）加poly (A）信號可以起到穩定mRNA 作用

　　選擇載體主要依據構建的目的，同時要考慮載體中應有合適的限制酶切位點。如果構建的目

　　的是要表達一個特定的基因，則要選擇合適的表達載體。載體選擇主要考慮下述3點:

　　【1】構建DNA重組體的目的，克隆擴增/基因表達，選擇合適的克隆

　　載體/表達載體。

　　【2】.載體的類型:

　　(1）克隆載體的克隆能力一據克隆片段大小(大選大，小選小)。如

　　<10kb選質粒。

　　(2）表達載體據受體細胞類型一原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳類細胞表

　　達載體。

　　(3)對原核表達載體應該注意:選擇合適的啟動子及相應的受體菌，

　　用于表達真核蛋白質時注意克服4個困難和閱讀框錯位;表達天然蛋白質或融合蛋白作為相應載體的參考。

　　【3】載體MCS中的酶切位點數與組成方向因載體不同而異，適應目的基因與載體易于鏈接，不能產生閱讀框架錯位。

　　綜上所述，選用質粒做載體的5點要求:

　　(1）選分子量小的質粒，即小載體（ 1—1.5kb）→不易損壞，在細菌里

　　面拷貝數也多（也有大載體）;

　　(2）一般使用松弛型質粒在細菌里擴增不受約束，一般10個以上的拷

　　貝，而嚴謹型質粒<10個。

　　(3）必需具備一個以上的酶切位點，有選擇的余地;

　　(4）必需有易檢測的標記，多是抗生素的抗性基因，不特指多位 Ampr(試一試)。

　　(5)滿足自己的實驗需求，是否需要包裝病毒，是否需要加入熒光標記，

　　是否需要加入標簽蛋白，是否需要真核抗性（如 Puro、G418）等等。

　　無論選用哪種載體，首先都要獲得載體分子，然后采用適當的限制酶將載體DNA進行切割，獲得線性載體分子，以便于與目的基因片段進行連接。