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用[35S]蛋氨酸和[35S]半胱氨酸標記哺乳動物細胞的方法

時間:2021/11/8閱讀:2512
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材料與儀器

細胞
培養基

實驗步驟

1. 制備活躍生長著的細胞。從單層培養細胞(約鋪滿 75% 表面積)中吸去培養基。用預熱至 37℃ 的無血清培養基沖洗兩次(培養基中應該不含蛋氨酸和半胱氨酸)。對于懸浮培養細胞,通過 400 g 離心 5 分鐘收集細胞。用頂熱至 37℃ 的無蛋氨酸培養基重懸沉淀,400 g 離心 5 分鐘。盡可能地去掉上清,用無蛋氨酸培養基重懸細胞至 107 細胞/ml 后轉移至一塊小培養板。

2. 加入預熱的無蛋氨酸和半胱氨酸的培養基,于 37℃ 培養 20 分鐘,以耗盡胞內含硫氨基酸庫。

3. 吸去培養基,立刻換上預熱的、無蛋氨酸和半胱氨酸何含有適量標記氨基酸的新鮮培養基,依據預實驗結果,將細胞于 37℃ 培養一定時間(對于末做過預實驗的蛋白質,以 2~4 小時作為初始值比較合適)

4. 移去放射性培養基。對于單層培養細胞,吸出即可。懸浮培養細胞則可轉至試管,400 g 離心 5 分鐘,倒去上清。

5. 準備一塊凍至 0℃ 的平板(如放在冰盒上的鋁板),將單層細胞培養板放上去。用冰冷的 PBS 沖洗兩次,沖洗液都到進放射性廢料桶。懸浮培養細胞用 PBS 重懸,400 g 離心 5 分鐘,倒去上清。

6. 抽干細胞上殘留的 PBS,裂解細胞。


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