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大鼠肝星狀細胞培養技術

時間:2021/12/6閱讀:1348
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材料與儀器

雄性 SD 大鼠
戊巴(匕匕)妥鈉 小牛血清 DMEM 酶消化液I、Ⅱ Nycodenz D-Hanks’液 HBSS 臺盼蘭
手術器械 尼龍網 相差顯微鏡 熒光顯微鏡

步驟


一、實驗步驟
 

1. 大鼠腹腔麻醉后在超凈臺上剖腹,進行門靜脈插管。
 
2. 以D-Hanks‘液灌注,同時剪開下腔靜脈,沖掉血液后,改灌以100 ml 酶消化液I(0.05% IV 型膠原酶)。
 
3. 待肝臟變軟后,離體肝臟并剪碎,繼續以酶消化液II(含20U/ml DNase I 的0.05% IV 型膠原酶)消化15 min,尼龍網過濾后以450 g 離心5 min(4℃,下同)。
 
4. 以HBSS 重懸沉淀至10 ml,再混以20 ml Nycodenz 液,分置于離心管中,并分別覆以2-3 ml HBSS,1450 g 離心16 min 后取界面細胞。
 
5. 以HBSS重懸后再次離心收集細胞,以DMEM重懸后進行細胞計數,并判斷存活率和產量,最后按照常規方法接種(105 細胞/cm2 ),次日換液,以后每2-3 天換液一次。
 
6. 傳代方法:棄去培液后以D-Hanks’液洗兩次,加0.125%胰酶(原代最好加0.05% EDTA)消化,鏡下觀察細胞突起回縮(2-5 min左右),以*培液(DMEM+10% NBS)終止反應(若不用EDTA,可以不需離心), 充分吹打后以 1:2-1:3 接種,然后繼續培養(5% CO2,37℃)。


二、結果

接種次日,光鏡下可見細胞呈星芒狀,胞質內有脂滴,熒光鏡下328  nm 處見自發熒光。附照片(圖 1)。

 

圖 1. 原代培養第 2 天的大鼠肝星狀細胞


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