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輔助方案 TCA 沉淀測定標記摻入量

時間:2022/3/10閱讀:1510
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原理

材料與儀器

被標記的細胞懸液(見基本方案或備擇方案 1~4)
0.1%(m V)BSA/0.02%(m V)NaN3 10%TCA 溶液 冷凍乙醇
連接真空管道的濾過裝置 2.5 cm 玻璃微纖維濾膜(Whatman GF/C)

步驟

1. 加 10~20 μl 被標記的細胞懸液到 0.1 ml 0.1%(m/V)BSA/0.02%(m/V)NaN3 中,置于冰上。


2. 加 1 ml 冷凍的 10%(m/V)TCA 溶液。劇烈振蕩混勻,在冰上孵育 30 min。


3. 在真空濾過裝置內,濾過細胞懸液到 2.5 cm 玻璃微纖維濾膜上。


4. 用 5ml 冷凍 10%TCA 溶液洗膜 2 次,再用乙醇洗 2 次??諝飧稍?30 min。


5. 在玻璃微纖維濾膜上點同樣體積(見步驟 1,10~20 μl)的放射性標記的細胞懸液,在空氣中干燥。


6. 轉移濾膜到 20 ml 閃爍管里,加 5 ml 閃爍記數溶液,用閃爍記數儀測定放射活性。


7. 計算 TCA 沉淀標記(見步驟 4)與總放射活性的比值(見步驟 5)。

注意事項

1. TCA 有強烈腐蝕性。在制備和操作 TCA 溶液時注意保護眼睛并避免皮膚接觸。

2. 洗液應按照混合化學/放射性廢棄物處理。根據安全規程進行處理。

常見問題

同實驗其他方法

氨基酸代謝標記實驗

1. 室溫融化 [35S] 標記甲硫氨酸,并用預熱的(37℃)脈沖標記培養基制備 0.1~0.2 mCi/ml 的工作溶液。2. 室溫下 300 g 離心 5 min,獲得懸液中 0.5 × 107~

備擇方案 1 對貼壁細胞

1. 在 100 mm 組織培養皿中培養細胞到 80%~90% 融合(0.5 × 107~2 × 107 細胞,取決于細胞類型)。2. 如上所述制備 [35S] 甲硫氨酸的工作液體(見基本方案步驟 1

備擇方案 2 示蹤標記細胞

1. 每個時間點和每個樣品準備 0.5 × 107 ~2 × 107 細胞, 每 0 .5 × 107 ~2 × 107 細胞用 2 ml 0.1~0.2 mCi/ml [35S] 甲硫氨酸脈沖標記

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安培生物堅持為生命科學研究、活體動物轉染、大規模生物生產、基因和細胞治療領域客戶,提供*細胞體內可代謝的核酸轉染試劑;inviCELL™Platelet lysate無動物血清產品旨在支持廣泛的細胞擴增和生產,包括培養間充質干細胞和多種免疫細胞系等,為制藥公司或者生物技術公司提供無血清細胞培養規模生產服務;提供以植物生物為平臺基因序列全人源化、*的細胞培養可分解3D基質膠產品;提供內毒素≦ 1.0 EU/mL、對細胞無毒性影響、高純度的一型膠原蛋白產品。安培生物專注為生物醫藥領域提供優質的產品和技術服務,努力發展為基因治療、細胞治療的生物科技企業。


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