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斑點和狹縫雜交

時間:2022/3/24閱讀:1514
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材料與儀器

去離子甲酰胺 甲醛(37%) 20XSSC NaOH 預雜交液
狹槽 點樣器 真空泵 可燙封塑料袋或雜交管 硝酸纖維 K 膜或尼龍膜 Whatman3MJV1 濾紙

步驟

一、材料與設備

1) 狹槽

2) 點樣器

3) 真空泵

4) 可燙封塑料袋或雜交管

5) 硝酸纖維 K 膜或尼龍膜

6)Whatman3MJV1 濾紙

7) 去離子甲酰胺

8) 甲醛(37%)

9)20XSSC

10)0.1mol/LNaOH

11) 預雜交液:50% 甲酰胺,5XSSC,2XDenhardt, 0.1%SDS,100ug/ml 鮭精 DNA。

二、操作方法

(-)樣品處理

將 l0ulRNA10ug,(RNA 可多至 50ug) 水溶液與下述溶液混合:

甲酰胺                                                  20ul

甲醛(37%)                                                     7ul

20XSSC                                                          2ul

于 60℃ 溫育 15 min 使其變性,冰浴冷卻樣品。

(二)點樣

用 0.lmol/LNaOH 清洗點樣器,再用 DEPC 水充分沖洗。將一張經 20XSSC 浸潤的 Whatman3 MM 濾紙鋪在點樣器上,上面鋪張經 20XSSC 浸潤 30 min 的硝酸纖維素膜,加蓋并夾緊,接通真空泵。用 10XSSC 清洗各樣孔。在每一 RNA 樣品中加 2 倍體積的 20XSSC,混合后加樣。于外圍幾個孔中加染料定位,緩慢抽吸,毎孔用 lml10XSSC 淸洗 2 次。繼續抽吸 5 min,吸干濾膜。

(三) 固定

取出濾膜,室溫晾干后,夾在 2 張 Whatman3 MM 濾紙中間,80℃ 干烤 2 h 以固定RNA

(四)預雜交

濾膜烘干后放入可燙封塑料袋 (或雜交管)中,加入 20?30 ml 預雜交液,密封塑料袋后在 42°C 預雜交 3 h

(五)探針制備及標記

參見前面相關章節。

(六)雜交

將已標記的探針煮沸變性 l0 min,取出后立即置冰浴 10 min(單鏈探針不需要變性),將變性探針加入預雜交液中,密封雜交塑料袋后在 42℃ 雜交過夜。

(七)洗膜

雜交結束后,分別用下列洗液洗膜:

1)2XSSC,0.5%SDS,室溫洗膜 5 min。

2)1XSSC,0.1%SDS,42°C 洗膜 30rnin。

0.1XSSC,0.5%SDS,56℃ 洗膜 30 min。

(八)檢測

用 X 射線片進行放射性自顯影,附加增感屏,一 70°C 曝光 7?10 天。

注意事項

1) 使用快速制備法獲得的細胞總 RNA 有可能污染基因組 DNA, 因此難以用分光光度計來精確測定 RNA 含量。此外還必須防止上樣矯作物的出現。對半定最分析來說,每一樣品須做兩次狹縫印跡,一張膜與所要檢測的 RNA 探針雜交,另一張則與另-種RNA 探針雜交,這種在各個樣品中的表達都應一樣,或者也可以對一個樣品制作-次印跡,但同一張膜必須進行兩次重復雜交。

2)RNA 樣品在點樣時要稀釋 8 倍,因此樣品的濃度至少為 10mg/mL

3) 狹縫雜交很容易出現假陽性性信號。這可通過以下手段盡可能的避免:①用 Northern 印跡方法嚴格鑒定探針的特異性;②在所用測試中均需要有適當的陰性對照;③須非常細心地制備所用探針、溶液、RNA 等以避免污染。

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安培生物堅持為生命科學研究、活體動物轉染、大規模生物生產、基因和細胞治療領域客戶,提供*細胞體內可代謝的核酸轉染試劑;inviCELL™Platelet lysate無動物血清產品旨在支持廣泛的細胞擴增和生產,包括培養間充質干細胞和多種免疫細胞系等,為制藥公司或者生物技術公司提供無血清細胞培養規模生產服務;提供以植物生物為平臺基因序列全人源化、*的細胞培養可分解3D基質膠產品;提供內毒素≦ 1.0 EU/mL、對細胞無毒性影響、高純度的一型膠原蛋白產品。安培生物專注為生物醫藥領域提供優質的產品和技術服務,努力發展為基因治療、細胞治療的生物科技企業。

 

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