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科研小白入門必修之MTT實驗操作總結

時間:2022/6/8閱讀:4065
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MTT實驗也叫細胞存活分析實驗,是一種接受氫離子的染料,可作用于活細胞線粒體中的呼吸鏈,在琥珀酸脫氫酶(SDH)和細胞色素-C的作用下四氮唑環會開裂,生成紫色的甲?結晶,利用DMSO將甲?溶解出來之后,再利用吸光度的測定去評估有多少細胞存活。



細胞增殖實驗操作

1.接種細胞:用含10%胎小牛血清得培養液配成單個細胞懸液,以每孔1000-10000個細胞接種到96孔板,每孔體積180ul-200ul.

2.培養細胞:同一般培養條件,正常培養2-3天也可根據試驗目的和要求決定培養時間。

3.顯色:每孔加MTT溶液(5mg/ml用PBS 配)20ul.繼續孵育4小時,終止培養,小心吸棄孔內培養上清液,對于懸浮細胞需要離心后再吸棄孔內培養上清液。每孔加150ul DMSO,振蕩10分鐘,使結晶物充分融解。

4.比色:選擇480nm-570nm波長,在酶聯免疫檢測儀上測定各孔光吸收值,記錄結果,以時間為橫坐標,吸光值為縱坐標繪制細胞生長曲線。


細胞增殖實驗結果計算

以時間為橫軸,光吸收值為縱軸繪制細胞生長曲線或計算細胞生長抑制率、細胞相對增殖率等。


前方高能,MTT實驗預警

1.細胞消化。若消化出現問題,則會影響細胞的活性,進而影響 OD 值。對于 MCF-7、BT474等一系列容易消化的細胞,消化時胰蛋白酶中不添加 EDTA,只需胰酶浸潤數秒即可。然而,對于caco-2等一系列難以消化的細胞,胰蛋白酶中可添加濃度為 0.25% 的 EDTA。

2.選擇適當得細胞接種濃度。

3. 結晶物的溶解。加入 DMSO 溶解后,將加入DMSO的96孔板放入37℃ 孵箱內孵育 10~20 min,這樣有助于 DMSO對紫色結晶物的溶解(尤其在冬天)。

4..避免血清干擾:一般選小于10%的胎牛血清的培養液進行試驗。在顯色后盡量吸盡孔內殘余培養液,棄去培養液時,吸取的時候要注意移液頭要緊貼孔內側壁吸取,不要觸碰底部的紫色結晶;或者將96孔板倒扣于濾紙上來吸取孔內的培養液。

5.設空白對照:與試驗平行不加細胞只加培養液的空白對照。其他試驗步驟保持一致,最后比色以空白調零。每組設定3復孔。

6.MTT粉末和溶液保存時都需要避光,用鋁箔紙包好就可以。

7.酶聯免疫檢測儀使用前應打開電源預熱半小時。

8.選擇不同的波長,酶聯免疫檢測儀檢測靈敏度不同。應根據實驗目的選擇相應的波長。




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