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干細胞養成記

閱讀:234      發布時間:2025-6-4
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干細胞是怎樣“養出來"的?



一、清洗與分離:獲取富含MSC的“華通氏膠"組織

1、材料準備

新鮮臍帶組織(最好在出生后36小時內處理)

無菌PBS(磷酸鹽緩沖鹽水)、無菌手術刀、無菌剪刀/鑷子、10cm無菌解剖皿、50ml離心管

2、去除雜質

將臍帶置于無菌解剖皿中,用PBS反復沖洗,去除殘余血液及運輸液體。

建議切割成約5cm的小段,便于后續操作。

3、分離血管與華通氏膠

在每一小段臍帶上縱向淺切一刀,注意不要切穿血管。

用鑷子輕輕扒開臍帶,露出中央的兩條動脈和一條靜脈。

用鑷子將血管連同包裹的白色膠狀組織(血管周圍的“華通氏膠")分離出來。

小心操作,盡量避免損傷血管內皮層,減少其他細胞污染。

4、剝離與切塊

剝離下來的“華通氏膠"組織,用剪刀/手術刀切成1~3mm見方的小塊,保持組織濕潤,避免干燥。

組織塊可暫時放在含PBS的離心管中,靜置備用。



二、切割與鋪板:為細胞“安家"

1、準備培養器皿

選擇適合的培養瓶(如T25、T75等),事先用適宜的細胞貼壁底物處理(常見為膠原或專用貼壁液),按說明書比例稀釋并包被,室溫靜置2小時后備用。

2、移植組織塊

用寬口移液器或無菌鑷子,將1~3mm見方的華通氏膠組織塊均勻放置在培養瓶底部。

建議每瓶間距均勻,不要堆疊,確保每塊都有接觸瓶底的機會,有利于貼壁。

3、添加培養基

緩慢加入預熱好的間充質干細胞專用培養基,通常8~10ml/瓶(以T75為例),覆蓋組織塊但不宜太多,以免組織漂浮。

4、初期培養

放入37℃、5% CO?培養箱,靜置5~7天,期間不宜移動,以便組織塊穩定貼壁。

觀察培養基顏色,不宜wan全變黃或干涸,必要時可補充部分新鮮培養基。



三、培養與換液:細胞“爬出"與擴散

1、首ci換液

培養5~7天后,大多數組織塊已牢固貼壁,可進行“半量換液":傾斜瓶體,用移液器吸走一半舊培養基,慢慢補充等量新鮮培養基。

輕操作,避免擾動組織塊。

2、后續觀察

繼續培養,每3-5天換液一次。隨著時間推移(通常10-14天),會發現細胞逐漸從組織塊“爬"出,鋪展在瓶底,數量逐漸增多。

3、細胞長滿(融合度70~80%)時處理

細胞生長速度根據組織塊數量、初始樣本質量等因素略有不同。一般10~18天左右,細胞可達到傳代標準。



四、收獲與擴增:獲得大量MSC

1、去除組織塊

先棄去培養基,用PBS輕輕沖洗瓶底,去除未貼壁的組織塊及漂浮細胞。

2、消化收獲

加入適量細胞消化液(如胰酶/膠原酶混合液),37℃孵育6~8分鐘。

輕輕拍打瓶壁,顯微鏡下觀察,細胞開始脫落。

3、終止消化與收集

加入等體積含血清或專用消化終止液終止反應。

細胞濾網(70μm)過濾,收集單細胞懸液,棄去殘余組織塊。

4、離心與再接種

300g離心10分鐘,棄上清,PBS重懸。

細胞計數,按1500~3000個/cm2密度接種到新培養瓶中,繼續擴增。

2-3天后細胞可達70-80%融合度,再進入下次傳代。





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