雙光子顯微鏡的基本原理是：在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時吸收 2 個長波長的光子，在經過一個很短的所謂激發態壽命的時間后，發射出一個波長較短的光子；其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發熒光分子是相同的。雙光子激發需要很高的光子密度，為了不損傷細胞，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脈沖寬度只有 100 飛秒，而其周期可以達到 80至100兆赫茲。在使用高數值孔徑的物鏡將脈沖激光的光子聚焦時，物鏡的焦點處的光子密度是最高的，雙光子激發只發生在物鏡的焦點上，所以雙光子顯微鏡不需要共聚焦針孔，提高了熒光檢測效率。
從雙光子的原理和特點我們就可以明顯的得出雙光子的優點：
光損傷小：由于雙光子顯微鏡使用的是可見光或近紅外光作為激發光源，這一波段的光對活體細胞和組織的光損傷小，適用于長時間的研究；
穿透能力強：相對于紫外光，可見光和近紅外光都具有更強的穿透能力，因而受生物組織散射的影響更小，解決對生物組織中深層物質的層析成像研究問題；
高分辨率：由于雙光子吸收截面很小，只有在焦平面很小的區域內可以激發出熒光，雙光子吸收僅局限于焦點處的體積約為波長3次方的范圍內；
漂白區域小：由于激發只存在于交點處，所以焦點以外的區域都不會發生光漂白現象；
熒光收集率高：與共聚焦成像相比，雙光子成像不需要光學濾波器（共焦針孔），這樣就提高了對熒光的收集率，而收集率的提高直接導致圖像對比度的提高；
圖像對比度高：由于熒光波長小于入射波長，因而瑞利散射產生的背景噪聲只有單光子激發時的1/16，大大降低了散射的干擾；
光子躍遷具有很強的選擇激發性，所以可以對生物組織中一些特殊物質進行成像研究；
避免組織自發熒光的干擾，獲得較強的樣品熒光：生物組織中的自發熒光物質的激發波長一般在350~560nm范圍內，采用近紅外或紅外波段的激光作為光源，能大大降低生物組織對激發光吸收。
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