考馬斯亮藍法測蛋白含量測定試劑盒說明書
微量法 100T/96S
注 意：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。
測定意義：
樣品可溶性蛋白質含量常常用于酶活性計算。此外，可溶性蛋白質含量也用于食品等質量分析。
測定原理：
在酸性溶液中，考馬斯亮藍G-250與蛋白質結合形成藍色復合物；該復合物在620nm處有最大吸收峰， 其顏色的深淺與蛋白質的濃度成正比。該方法靈敏度高，適合微量蛋白質分析。
自備儀器和用品：
離心機、酶標儀、96孔板、移液器和蒸餾水。
試劑組成和配制：
試劑一：液體11 mL×1瓶，4℃保存。
樣品中可溶性蛋白質提取：
1. 液體樣品：澄清液體樣品可以直接測定。
2. 組織樣品：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為1：20的比例（建議稱取約0.05 g組織，加入1mL提取液（自備，根據需要選用酶提取緩沖液或者蒸餾水或者生理鹽水））
冰浴勻漿，8000g，4℃離心10min，取上清，即待測液。（動物樣品常常需要稀釋）
3. 細菌、真菌：按照細胞數量（104個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后8000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測。
測定操作：
1. 酶標儀預熱30 min。
2. 在96孔板中加入：
試劑（μL） | 測定管 | 空白管 |
樣本 | 100 | |
蒸餾水 | 100 | |
試劑一 | 100 | 100 |
混勻后，測定波長620 nm吸光值，△A=A測定-A空白。 | ||
注意：空白管只需要測定一次。
計算公式：
標準曲線：y = 7.1265x - 0.0007 R2 = 0.9997 x: 蛋白標準品濃度(mg/mL)
y: 吸光值差值
1.按液體樣本體積計算：
Cpr（mg/mL）=(△A+0.0007)÷7.1265
=0.1403×(△A+0.0007)
2.按組織樣本質量計算：
Cpr（mg/g）=(△A+0.0007)÷7.1265×V總÷W
=0.1403×(△A+0.0007)÷W
V總：提取液體積，1 mL; W：樣本質量，g。
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