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乙醇脫氫酶(ADH)活性測定試劑盒說明書

閱讀:521      發(fā)布時間:2023-05-05
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乙醇脫氫酶(ADH)活性測定試劑盒說明書

                                             微量法 100T/96S

   意:正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

測定意義:

ADH是生物體內(nèi)短鏈醇代謝的關(guān)鍵酶,催化乙醇與乙醛可逆轉(zhuǎn)換,在很多生理過程中起著重要作用。哺乳動物ADH主要在肝臟生成,肝臟損傷導(dǎo)致ADH釋放到血清中。血清ADH活性高低反映了肝功能是否異常。

測定原理:

ADH催化NADH還原乙醛生成乙醇和NAD+NADH340nm處有吸收峰,而NAD+沒有;測定340nm 吸光度下降速率,來計算ADH活性。

自備儀器和用品:

研缽、冰、低溫離心機、紫外分光光度計/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、可調(diào)式移液器和蒸餾水。

試劑組成和配制:

試劑一:液體×1瓶,室溫保存。

試劑二:液體×1瓶,4保存。              

試劑三:粉劑×2瓶,-20℃保存,臨用前每瓶加入9mL試劑二,現(xiàn)配現(xiàn)用。

試劑四:液體×1支,4保存。

粗酶液提取:

1、   組織:按照組織質(zhì)量(g:試劑一體(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL試劑一)進行冰浴勻漿。16000g4離心20min,取上清置冰上待測。

2、   細菌、真菌:按照細胞數(shù)量(104個):試劑一體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬細胞加入1mL試劑一),冰浴超聲波破碎細胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min);16000g 4離心20min,取上清液置冰上待測。

3、血清等液體:直接測定。

ADH測定操作:

1. 分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min,調(diào)節(jié)波長到340 nm,蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑三在25水浴中保溫30 min

3. 在微量石英比色皿/96孔板中依次加入20μL樣本上清液、160μL試劑三和20μL試劑四,迅速混勻后于340nm測定吸光值變化,分別記錄15s75s時吸光值,分別記為A1A2A測定管=A1-A2

計算公式:

a. 使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1)按照蛋白濃度計算

活性單位定義:25中每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol NADH 1個酶活單位

ADH (nmol/min/mg prot) =(A÷ε÷d×V反總×109)÷(Cpr×V)÷T

=1608×A ÷Cpr

2)按照樣本質(zhì)量計算

活性單位定義:25中每克組織每分鐘氧化1nmol NADH 1個酶活單位

ADH (nmol/min/g 鮮重) =(A÷ε÷d×V反總×109)÷(W×V÷V樣總)÷T

=1608×A ÷W

3)按細胞數(shù)量計算

活性單位定義:25中每104個細胞每分鐘氧化1nmol NADH 1個酶活單位

ADH (nmol/min/104cell) = (A÷ε÷d×V反總×109) ÷(細胞數(shù)量×V÷V樣總)÷T

=1608×A ÷細胞數(shù)量

4)按液體體積計算

活性單位定義:25中每毫升血清每分鐘氧化1nmol NADH 1個酶活單位

ADH (nmol/min/mL) =(A÷ε÷d×V反總×109) ÷V÷T

=1608×A

εNADH摩爾消光系數(shù),6.22×103L/mol/cmd:比色皿光徑,1 cmV反總:反應(yīng)體系總體積,200μL=2×10-4 LCpr:上清液蛋白質(zhì)濃度,mg/mLW :樣品質(zhì)量;V樣:加入反應(yīng)體系中上清液體積,20μL=0.02 mLV樣總:提取液體積,1 mLT:反應(yīng)時間,1min

b.使用96孔板測定的計算公式如下

1)按照蛋白濃度計算

活性單位定義:25中每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol NADH 1個酶活單位

ADH (nmol/min/mg prot) =(A÷ε÷d×V反總×109) ÷(Cpr×V)÷T

=3215×A÷Cpr

2)按照樣本質(zhì)量計算

活性單位定義:25中每克組織每分鐘氧化1nmol NADH 1個酶活單位

ADH (nmol/min/g 鮮重) =(A÷ε÷d×V反總×109) ÷(W×V÷V樣總)÷T

=3215×A÷W

3)按細胞數(shù)量計算

活性單位定義:25中每104個細胞每分鐘氧化1nmol NADH 1個酶活單位

ADH (nmol/min/104cell) =(A÷ε÷d×V反總×109) ÷(細胞數(shù)量×V÷V樣總)÷T

=3215×細胞數(shù)量

4)按液體體積計算

活性單位定義:25中每毫升血清每分鐘氧化1nmol NADH 1個酶活單位

ADH (nmol/min/mL) =(A÷ε÷d×V反總×109) ÷V÷T

=3215×A

εNADH摩爾消光系數(shù),6.22×103L/mol/cmd96孔板光徑,0.5 cmV反總:反應(yīng)體系總體積,200μL=2×10-4 LCpr:上清液蛋白質(zhì)濃度,mg/mLW :樣品質(zhì)量;V樣:加入反應(yīng)體系中上清液體積,20μL=0.02 mLV樣總:提取液體積,1 mLT:反應(yīng)時間,1min


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