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DNA甲基化分析

時間:2023/10/17閱讀:671
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1.什么是DNA甲基化?

DNA甲基化是在DNA甲基化轉移酶(Dnmt)的作用下將甲基選擇性地添加到胞嘧啶上形成5-甲基胞嘧啶(5-mC)的過程。



2.DNA甲基化與基因表達調控

DNA復制后胞嘧啶的甲基化會改變DNA的構象,使DNA的大溝無法與DNA結合蛋白正常結合,從而使這些非編碼區長期保持無表達活性的狀態。而有轉錄活性的基因可利用非甲基化的啟動子來進行轉錄表達。



3.DNA甲基化主要發生在CpG位點

CpG位點(CpG sites)是指DNA的某個區域,其上的堿基序列以胞嘧啶接著鳥嘌呤出現。“CpG"是“C—磷酸—G"的縮寫。 CpG位點在人類基因組上并非隨機分布,在人類基因組上的頻率為1%。

• DNA甲基化主要發生在CpG位點。在哺乳動物中,70%到80%的CpG位點的胞嘧啶是甲基化的。

• CpG島是一個富含CpG位點的區域,通常定義為:一個長度至少為200bp的片段

,其GC含量高于60%,主要位于基因的啟動子區(70%的基因)。

二、全基因組甲基化研究策略



優點:通量高 ,全基因組范圍;單堿基分辨率。

缺點:成本高,不適于大樣本研究分析;不適于特異位點、基因或區段研究。

三、特異位點甲基化研究策略

Bisulfite sequencing PCR (BSP): 基因組DNA經亞硫酸氫鹽處理后,設計BSP引物擴增目的片段,最后對PCR產物進行克隆并選取8-10個轉化子序列,即可確定所研究的CpG區域的甲基化頻率。



Methylation specific PCR (MSP) :首先用亞硫酸氫鈉修飾處理基因組DNA,然后針對甲基化和非甲基化引物進行PCR擴增,確定與引物互補的DNA序列的甲基化狀態。



缺點:通量太小、無法精確定量

翼和方法:

Bisulfite Amplicon Sequencing (BSAS)



優勢:BSAS 結合了亞硫酸鹽轉換、靶向擴增子高通量測序技術,可實現多區段、多位點的甲基化精確定量分析。

應用:1、 適用于感興趣的目的片段的甲基化研究 ;

2、適用于在大樣本中進一步確認全基因組甲基化研究挑選的陽性位點。

文獻:1、 Masser et al. Epigenetics & Chromatin 2013, 6:33

2、Ashktorab et al. Epigenetics 2014, 9(4): 503-512

3、Beth et al. J CHILD PSYCHOL PSYC 2016,2(57):152-160



關鍵點-引物設計

盡量避免CpG位點,無法避免時,可設計兼并引物;

經亞硫酸鹽處理后,兩條DNA鏈不再互補,一般需要設計鏈特異性引物用于PCR擴增;



如果只選一條鏈進行研究,一般選擇正義鏈。



關鍵點-轉換效率

亞硫酸鹽處理是一化學過程,可造成DNA的損傷,很難同時實現轉換效率和保持DNA的完整性,二者需要做出一定的平衡。

轉換效率 = 未轉換堿基讀數/總堿基讀數 【針對DNA序列中的C位點】

如何評估轉換效率?

? 在植物中,葉綠體中不含甲基胞嘧啶 DNA,因此,可用葉綠體DNA序列信息作為內對照,評估轉換效率。

? 在動物中,可通過在試驗中加入未發生甲基化的外源DNA序列(通常為噬菌體DNA)來評估轉換效率;此外,還可利用CpG位點以外的C位點信息來評估。

關鍵點-目的片段富集

采用巢式PCR,確保目的片段有效富集



經亞硫酸鹽處理后,DNA序列復雜度嚴重降低。應嚴格控制建庫PCR的循環數,降低非特異性擴增。



關鍵點-甲基化判斷

通過將參考序列中的C堿基全部替換為T堿基,然后將測序reads比對到轉換后的參考序列上,針對每一個CpG位點,統計C和T堿基的讀數(類似于SNP calling),來判斷該位點的甲基化。



甲基化率:對于每一個CpG位點,甲基化率 = C堿基讀數/該位點測序覆蓋度。



甲基化狀態:利用內對照得出的轉換效率作為期望概率,通過二項分布統計,得到p值,判斷每個CpG位點是否發生甲基化,多位點分析時,通常需要對p值進行矯正(錯誤發生率,FDR)。




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