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| 供貨周期 | 一周 | 規(guī)格 | 500U |
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| 貨號 | T5206 |
T4 Polynucleotide Kinase（T4 PNK）
貨號：T5206
保存：-20℃保存。
規(guī)格：500U
組成：
組分 | 規(guī)格 |
T4 Polynucleotide Kinase (10 U/μl) | 50ul |
10× T4 PNK Buffer | 1ml |
產品簡介
T4 Polynucleotide Kinase（T4 PNK），中文名稱 T4 多聚核苷酸激酶，是一種多聚核苷酸5'-羧基激酶，能夠催化ATP的 γ 磷酸基團轉移到寡核苷酸鏈（雙鏈或單鏈DNA 或者 RNA）或3'-單磷酸核苷上的5'-羥基末端，且該反應過程可逆。此外，T4 PNK還具有3'磷酸酶活性，可以將3'-磷酸基團從寡核苷酸的3'-磷酸末端、脫氧3'-單磷酸核苷和脫氧3'-二磷酸核苷上水解掉。
活性定義
1 活性單位 (U) 定義為在 1× T4 PNK Buffer 中，37℃、30 min 內使 1 nmol 的 [γ-32 P] ATP 摻入酸不溶性沉淀物所需要的酶量。
產品應用
1. 對 DNA 或 RNA 5' 末端進行磷酸化，以便進行連接反應。
2. DNA 或 RNA 的末端標記，用作探針和進行 DNA 測序。
3. 除去 3' 磷酸基團。
質量控制
蛋白純度
經 SDS-PAGE 凝膠電泳檢測，蛋白純度不低于 95%。
非特異性內切酶活性
37℃下，在 20 μl 反應體系中將 10 U T4 Polynucleotide Kinase 與200 ng超螺旋質粒DNA 共同溫育 4 h，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測， 少于20%的質粒DNA 轉變成缺刻或線性狀態(tài)。
DNase 活性
37℃下，在 20 μl 反應體系中將 10 U T4 Polynucleotide Kinase與15 ng 雙鏈DNA 片段共同溫育 16 h，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測，雙鏈DNA 片段無變化。
RNase 活性
37℃下，在 10 μl 反應體系中將 10 U T4 Polynucleotide Kinase 與500 ng RNA共同溫育 1 h，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測，超過 90%RNA 保持完整。
宿主 DNA 殘留
采用中國藥典 2020 版四部通則 3407 外源性 DNA 殘留量測定法第三法定量PCR 法，本品中大腸桿菌宿主細胞 DNA 殘留量低于 1 拷貝/10 U。
使用方法
1. DNA 5' 末端磷酸化：
試劑 | 使用量 |
底物 | 1~300 pmol (5' 末端 ) |
10× T4 PNK Buffera | 5 μl |
T4 Polynucleotide Kinase | 1 μl |
ATP (10 mM) | 5 μl |
ddH2O | Up to 50 μl |
a. 10 × T4 PNK Buffer 不含 ATP，需自行準備。
①將上述體系充分混勻后，37℃溫育 30 min；
②反應完成后，75℃溫育 10 min 使 T4 Polynucleotide Kinase 失活。
2. DNA 5' 末端標記：
試劑 | 使用量 |
底物 | 1~50 pmol (5' 末端 ) |
10× T4 PNK Bufferb | 5 μl |
T4 Polynucleotide Kinase | 2 μl |
[γ-32P]ATP (10 mM) | 0.25 μl |
ddH2O | Up to 50 μl |
b. 10× T4 PNK Buffer 不含放射性標記的 ATP ，需自行準備。
①將上述體系充分混勻后，37℃溫育30 min；
②反應完成后，75℃溫育 10 min 使 T4 Polynucleotide Kinase 失活。
注意事項
1. 金屬離子螯合劑、磷酸鹽、銨根離子、大于 50 mM 的 KCl 和 NaCl 均可顯著抑制 T4 Polynucleotide Kinase 的活性。
2. 聚乙二醇 (PEG) 和亞精胺可改善磷酸化反應的速率和效率。
3. 提高 ATP 的濃度可讓缺口磷酸化。切刻位點不能有效地磷酸化。CTP、GTP、TTP、UTP、dATP 及 dTTP 均可以替代 ATP 作為磷酸供體。
4. T4 Polynucleotide Kinase 使用時宜置于冰上，使用完畢后立即放置于-20℃保存。
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