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生物分子類實驗室常用實驗技術原理匯總-5
閱讀：455 發布時間：2014-12-9十一、BCA法測蛋白質濃度
十二、大腸桿菌感受態細胞（E.coli DH5α）制備
1、前夜接種受體菌（DH5?或DH10B），挑取單菌落于LB培養基中37℃搖床培養到第二日（約16小時）；
2、取1ml已培養到第二日的培養物轉接于100ml LB培養基中，在37℃搖床上劇烈振蕩培養約2.5-3小時（250-300rpm）；
3、將0.1M CaCl2溶液置于冰上預冷；以下步驟需在超凈工作臺和冰上操作；
4、吸取1.5ml培養好的菌液至1.5ml離心管中，在冰上冷卻10分鐘；
5、4℃下3000 g冷凍離心5分鐘；
6、棄去上清，加入100微升預冷0.1M CaCl2溶液，用移液槍輕輕上下吸動打勻，使細胞重新懸浮，在冰放置20分鐘；
7 、4℃下3000 g冷凍離心5分鐘；
8 、棄去上清，加入100微升預冷0.1M CaCl2溶液，用移液槍輕輕上下吸動打勻，使細胞重新懸浮；
9 、細胞懸浮液可立即用于轉化實驗或添加冷凍保護劑（15% - 20%甘油）后超低溫冷凍貯存備用（－70℃）。
十三、堿變性提取質粒DNA
堿變性提取質粒DNA是基于染色體DNA與質粒DNA的變性與復性的差異而達到分離目的。在pH高達12.6的堿性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結構解開而變性。質粒DNA的大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價閉合環狀的兩條互補鏈不會*分離，當以pH4.8的NaAc高鹽緩沖液去調節其pH至中性時，變性的質粒DNA又恢復原來的構型，保存在溶液中，而染色體DNA不能復性而形成纏連的網狀結構，通過離心，染色體DNA與不穩定的大分子RNA、蛋白質-SDS復合物等一起沉淀下來而被除去。
十四、目的基因的連接、轉化及克隆篩選
（1）總過程：
分---PCR分離目的基因
切---限制性內切酶切割
接---目的基因與載體相連
轉---轉入宿主細胞
篩---篩選陽性重組體
（2）分---PCR分離目的基因：PCR克隆、同源克隆、文庫篩選
（3）切---限制性內切酶切割：粘性末端、平末端
（4）接---目的基因與載體相連
原 理：利用DNA聚合酶反應時都有在PCR產物的3’末端添加一個或者幾個A堿基的特性和利用T載體3’末端的T堿基和PCR產物的A堿基互補配對,經連接酶作用,完成與載體的連接。
（5）轉---轉入宿主細胞
感受態細胞：經過電擊、 CaCl2、 RuCl等化學試劑處理后，細胞膜的通透性發生變化，成為能容許外源 DNA 分子通過時細胞的狀態。
（6）篩---篩選陽性重組體
十五、RNA干擾（RNAi）
一些小的雙鏈RNA(siRNA)可以通過促使特定基因的mRNA降解來、特異的阻斷體內特定基因表達，誘使細胞表現出特定基因缺失的表型，稱為RNA干擾（RNAi）。