糖基化是一種最常見的蛋白翻譯后修飾，唾液酸作為“橋梁”分子附著在聚糖的遠端，唾液酸化聚糖表現出廣泛的結構多樣性，這使他們在不同的生命過程中具有豐富的生物學功能，包括發育、體細胞重編輯和癌癥進展。
蛋白藥物中，唾液酸對糖蛋白的穩定性和3D構象很重要，并且具有關鍵性的功能作用。重組人促紅細胞生成素（EPO）廣泛應用于治療腎性貧血以及 腫瘤等各種慢性疾病所伴發的貧血。該藥物 是一種單鏈的酸性糖蛋白，分子量為 32000-39000Dar,EPO 的糖基包括 3 個 N2 糖 鏈（分別位于 Asp 24，Asp 38，Asp 83）和一個 O 糖鏈（位 于 Ser126）。他們的主要成分是甘露糖，巖藻糖和唾液酸等 [1]。其中，唾液酸在維持 EPO 分子的酸性，阻斷細胞表面半乳糖受 體結合，防止 EPO 失活等方面有重要作用 [2]。陰離子交換-親水相互作用的混合模式GlycanPac AXH柱子，既能將糖鏈按照唾液酸的數目進行分組，又能根據糖的羥基結構差異進行分離。創新性的解決高唾液酸蛋白糖型分離難題[3] [4]。方案如下：
樣品制備
本次樣品使用PNG酶酶切后，對比了經典的還原酶切和非還原酶切后使用2AB標記的N-糖鏈的分離情況，在整個樣品制備過程中，過量的標記試劑會干擾糖鏈，特別是低唾液酸糖鏈的出峰，所以使用了Hypersep Aminopropyl的氨基小柱進行凈化處理。該氨基小柱可以高效地除掉過量的標記試劑，得到優異的糖型分離結果。
GlycanPac AXH UHPLC色譜柱VS GlycanPac AXH HPLC色譜柱分析結果
UHPLC色譜柱更小的粒徑能夠得到更多的組分信息，特別是高唾液酸含量的EPO N糖，如圖（1）和圖（2）所示，圖（3）和圖（4）所示，無論是非還原酶切和還原酶切的樣品，Glypac AXH 1.9 μm的UHPLC色譜柱能夠將組內的N糖分離的更好，遠超過HPLC的結果，兩根柱子都可以將N糖分成5組。
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GlycanPac AXH色譜柱下，非還原酶切VS還原酶切重復性對比結果
在多次平行實驗過程中，如圖（5）和圖（6）所示，發現非還原酶切的重現性優于還原 酶切的重現性。
總 結
陰離子交換-親水相互作用混合模式的GlycanPac AXH的UHPLC色譜柱，解決了高唾液酸樣品在親水相互作用模式下，分離度不夠，不同個數唾液酸修飾的糖鏈定性難題。對于高唾液酸蛋白分析提供了新的選擇。
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引用文獻：
[1] D avis J M , A rakaw a T, Strick land T W , et al. Biochemistry, 1987, 26: 2633—2638
[2] Dongm i C, M yungsoo K, Tongsei A. J. Chromatograph. B, 1996, 687: 189—199
[3] 李響， 中國新藥雜志，2024，33（6）
[4] GlycanPac AXH-1 Columns Product Manual
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