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NADP-蘋果酸酶(Malic enzyme,NADP-ME)試劑盒說明書

時間:2025/1/11閱讀:722
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NADP-蘋果酸酶(Malic enzyme ,NADP-ME)試劑盒說明

分光光度法 50 /48 

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定測定意義:

ME 廣泛存在于微生物、培養(yǎng)細(xì)胞、動物和植物胞漿中,尤其在植物組織中活性較高。ME 催化蘋果

酸氧化脫羧的可逆反應(yīng),產(chǎn)生丙酮酸和CO2,以及伴隨NAD(P)+的還原反應(yīng),是蘋果酸代謝的關(guān)鍵酶。 ME 活性與生物合成和抗氧化密切相關(guān)。近年來植物 ME 活性測定較多,已經(jīng)成為抗氧化研究的熱點。根據(jù)輔酶專一性和對底物特異性的不同,可將ME 分為NAD-ME(EC1.1.1.38)NADP-ME(EC1.1.1.40)。

測定原理:

NADP-ME 催化NADP+還原成 NADPH,在 340nm 下測定NADPH 增加速率。

組成:

 

產(chǎn)品名稱

BF6009-50T/48S

Storage

提取液:

60ml

4℃

試劑一:液體

60ml

4℃

試劑二:粉劑

1

-20℃

試劑三:粉劑

1

-20℃

說明書

一份

 

試劑二:粉劑×1 瓶,-20℃保存; 臨用前加入 50ml 試劑一充分振蕩,溶解待用,用不完的試劑分裝后-20

度保存,禁止反復(fù)凍融。

試劑三:粉劑×1 瓶,-20℃保存;臨用前加入 6ml 蒸餾水充分振蕩,溶解待用,用不完的試劑分裝后-20

度保存,禁止反復(fù)凍融。

 

自備儀器和用品:

紫外分光光度計、水浴鍋、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1 ml 石英比色皿和蒸餾水。

樣本的前理:

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備:

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞:先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104 個):提取液體積(ml 500~10001 的比例(建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1ml 提取液),超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞

冰浴,功率 20%或 200W,超聲 3s,間隔 10s,重復(fù) 30 次);14000g 4℃離心 10min,取上清,置冰上待測。

組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(ml) 15~10 的比例(建議稱取約 0.1g 組織,加入 1ml 提取液,進(jìn)行冰浴勻漿。14000g 4℃離心 10min,取上清,置冰上待測。

2、血清(漿)樣品:直接檢測。

測定步驟:

1、分光光度計預(yù)熱 30min 以上,調(diào)節(jié)波長至 340nm,蒸餾水調(diào)零。

2、在 1ml 石英比色皿中加入 50μL 樣本和 850μL 試劑二,混勻,30℃孵育 5min,加入 100μL 試劑三,混勻后立即記錄 340nm 處初始吸光值A1 1min 后的吸光值A2,計算ΔA=A2-A1。

NADP-ME 活性計算:

(1) 按樣本蛋白濃度計算:

單位的定義:每mg 組織蛋白每分鐘生成 1 nmol NADPH 定義為一個酶活力單位。

NADP-MEnmo/min/mg prot)=[ΔA×V 反總÷ε×d×109]÷(V ×Cpr) ÷T= 3215×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。

(2) 按樣本鮮重計算:

單位的定義:每g 組織每分鐘生成 1 nmol NADPH 定義為一個酶活力單位。

NADP-MEnmo/min/g 鮮重)=[ΔA×V 反總÷ε×d×109]÷(W× V ÷V 樣總) ÷T =3215×ΔA÷W

(3) 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算:

單位的定義:每 1 萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成 1 nmol NADPH 定義為一個酶活力單位。

NADP-MEnmo/min/104 cell=[ΔA×V 反總÷ε×d×109]÷(500×V ÷V 樣總) ÷T =6.43×ΔA

V 反總:反應(yīng)體系總體積,1×10-3 L;εNADPH 摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol /cmd:比色皿光徑, 1cm;V 樣:加入樣本體積,0.1 ml;V 樣總:加入提取液體積,1 mlT:反應(yīng)時間,1 minCpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/ml;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500 萬。


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