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生物細(xì)胞的凍存及復(fù)蘇

閱讀:1474        發(fā)布時(shí)間:2019/4/24
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        大家好今天喆圖小編給大家?guī)淼氖鞘褂?a href="http://www.acromondplus.com/st6188/">恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴鍋?zhàn)黾?xì)胞凍存和復(fù)蘇實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)方法原理

        細(xì)胞凍存及復(fù)蘇的基本原則是慢凍快融,實(shí)驗(yàn)證明這樣可以大限度的保存細(xì)胞活力。目前細(xì)胞凍存多采用甘油或二甲基亞砜作保護(hù)劑,這兩種物質(zhì)能提高細(xì)胞膜對水的通透性,加上緩慢冷凍可使細(xì)胞內(nèi)的水分滲出細(xì)胞外,減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成,從而減少由于冰晶形成造成的細(xì)胞損傷。復(fù)蘇細(xì)胞應(yīng)采用快速融化的方法,這樣可以保證細(xì)胞外結(jié)晶在很短的時(shí)間內(nèi)即融化,避免由于緩慢融化使水分滲入細(xì)胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對細(xì)胞造成損傷。

實(shí)驗(yàn)材料 細(xì)胞 
儀器、耗材 微量加樣槍、吸頭、離心管、凍存管、槍頭膠、塞移液管、玻璃瓶、紅血球計(jì)數(shù)板、記號(hào)筆、醫(yī)用橡皮、膏移液槍、超凈工作臺(tái)、離心機(jī)、恒溫水浴箱、冰箱、倒置相差顯微鏡、恒溫培養(yǎng)箱、液氮冰箱、

1. 儀器:凈化工作臺(tái)、 離心機(jī)、恒溫水浴鍋、冰箱(4℃、-20℃、-70℃)、倒置相差顯微鏡、恒溫培養(yǎng)箱、液氮冰箱。

3. 塑料器皿: 吸頭、槍頭、膠塞、移液管(10ml)、15ml離心管、凍存管(1~2ml)。

5. 試劑:D-Hanks液、小牛血清、培養(yǎng)液、雙抗(青霉素、鏈霉素)、胰蛋白酶(0.08%)、1NHCl、7.4%NaHCO3、DMSO(分析純)或無色新鮮甘油。

1. 配制含10%DMSO或甘油、10~20%小牛血清的凍存培養(yǎng)液。

3. 離心1 000 rpm,5 min。

5. 將細(xì)胞分裝入凍存管中,每管1~1.5 ml。

7. 凍存:標(biāo)準(zhǔn)的凍存程序?yàn)榻禍厮俾?1~-2℃/ min;當(dāng)溫度達(dá)-25℃以下時(shí),可增至-5℃~-10℃/min;到-100℃時(shí),則可迅速浸入液氮中。也可將裝有細(xì)胞的凍存管放入-20℃冰箱2 h ,然后放入-70℃冰箱中過夜,取出凍存管,移入液氮容器內(nèi)。

1. 從液氮容器中取出凍存管,直接浸入水浴鍋37℃溫水中,并不時(shí)搖動(dòng)令其盡快融化。

3. 離心, 1 000 rpm,5 min。

5. 次日更換一次培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)。收起

 2. 將凍存管放入液氮容器或從中取出時(shí),要做好防護(hù)工作,以免凍傷。

其他

二、慢凍程序

2. 簡易程序:將冷凍管(管口要朝上)放入紗布袋內(nèi),紗布袋系以線繩,通過線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口,按每分鐘溫度下降1~2 ℃的速度,在40 min內(nèi)降至液氮表面過夜,次晨投人液氮中。

 三、低溫保護(hù)劑的應(yīng)用 在細(xì)胞凍存時(shí)加入溫保護(hù)劑,能大大提高凍存效果。 常用的低溫保護(hù)劑是DMSO,它是一種滲透性保護(hù)劑,可迅速透入細(xì)胞,提高胞膜對水的通透性,降低冰點(diǎn),延緩凍結(jié)過程,能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外,在胞外形成冰晶,減少胞內(nèi)冰晶,從而減少冰晶對細(xì)胞的損傷。

1. 預(yù)先配制凍存液 (1)10%DMSO + 細(xì)胞生長液(20%血清+基礎(chǔ)培養(yǎng)液) (2)10%甘油+ 細(xì)胞生長液(20%血清+基礎(chǔ)培養(yǎng)液)

3. 加入1 ml細(xì)胞于凍存管中,密封后標(biāo)記冷凍細(xì)胞名稱和冷凍日期。液氮長期保存。

1. 快速解凍 凍存細(xì)胞從液氮中取出后,立即放入3中,輕輕搖動(dòng)冷凍管,使其在1 分鐘內(nèi)全部融化(不要超過3 分鐘)。

3. 如果細(xì)胞對冷凍保護(hù)劑特別敏感 解凍后的細(xì)胞應(yīng)先通過離心去除冷凍保護(hù)劑,然后再接種到含*生長培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中。

喆圖小編今天給大家?guī)淼氖鞘褂门囵B(yǎng)箱、恒溫水浴鍋?zhàn)黾?xì)胞凍存和復(fù)蘇實(shí)驗(yàn)。需了解詳情可咨詢喆圖客服。

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