基質(zhì)效應(yīng)(matrix effect/ matrix interference)是指樣品中的其他物質(zhì)可能對(duì)檢測(cè)目標(biāo)分析物的能力產(chǎn)生影響，在對(duì)生物樣品如血清、血漿、組織勻漿等的免疫檢測(cè)中最為常見，因?yàn)檫@類樣品中的許多成分如碳水化合物、蛋白質(zhì)、磷脂、代謝物等會(huì)干擾抗體與其目標(biāo)的結(jié)合，或抑制或增強(qiáng)信號(hào)，影響分析物的準(zhǔn)確定量[1]。
在臨床研究的生物分析中，基質(zhì)干擾更是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)，例如在血清和血漿中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種類型的干擾，通常是內(nèi)源性物質(zhì)如類風(fēng)濕因子、嗜異性抗體(針對(duì)不明確的抗原產(chǎn)生的抗體，呈現(xiàn)低親和力和弱結(jié)合)、人抗動(dòng)物抗體(HAAA,當(dāng)免疫系統(tǒng)與動(dòng)物抗體接觸時(shí)產(chǎn)生的高親和力抗體)以及其他血漿蛋白，如白蛋白、溶菌酶、纖維蛋白原等[2]，這些干擾因素直接影響檢測(cè)的靈敏度、特異性和變異性，導(dǎo)致分析物定量不準(zhǔn)確。
減少基質(zhì)效應(yīng)的最基本方法是樣品稀釋，但前提是稀釋后分析物的水平仍在線性范圍內(nèi)，而且稀釋會(huì)影響檢測(cè)靈敏度，所以并非通用的策略。優(yōu)化緩沖液pH和離子強(qiáng)度也有助于減少非特異性相互作用。其他克服干擾的策略包括加入與干擾分子結(jié)合或競(jìng)爭(zhēng)的物質(zhì)，如用適當(dāng)?shù)膭?dòng)物血清雞尾酒來(lái)被動(dòng)去除人類抗鼠抗體(HAMA)，使用嗜異性抗體抑制劑如嗜異性阻斷試劑(HBR)和免疫球蛋白抑制試劑(IIR)、或使用缺乏Fc片段的F(ab′)2或單鏈片段(scFv)作為捕獲/檢測(cè)試劑等[3]，然而這些方法大多數(shù)都是勞動(dòng)密集型的且價(jià)格昂貴，對(duì)于大樣本量的研究并不實(shí)用。
對(duì)于基于配體結(jié)合試驗(yàn)(ligand binding assay, LBA)的免疫檢測(cè)，減少孵育時(shí)間或檢測(cè)試劑與基質(zhì)接觸的時(shí)間已被證明是克服基質(zhì)效應(yīng)的有效手段之一[4]。Gyrolab®在微流控的CD上實(shí)現(xiàn)親和柱流穿模式，從而最大限度地減少了試劑與基質(zhì)的接觸時(shí)間，將基質(zhì)干擾最小化。Bristol-Myers Squibb公司的Shannon D Chilewski等人[5]利用Gyrolab®平臺(tái)解決了臨床前PK研究中的基質(zhì)干擾問題。
該案例是在對(duì)某一PEG化抗體的PK檢測(cè)中觀察到了來(lái)源于人抗動(dòng)物抗體(HAAA)的基質(zhì)干擾。在藥物發(fā)現(xiàn)階段，用于支持單次給藥劑量遞增(single ascending dose，SDA)研究的檢測(cè)方法是基于電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)(ECL)的方法，以靶點(diǎn)分子為捕獲試劑，山羊抗Vk抗體為檢測(cè)試劑，樣品稀釋度為50倍，定量下限LLOQ為80ng/mL。
但當(dāng)從發(fā)現(xiàn)階段過渡到開發(fā)階段時(shí)，要求更低的檢測(cè)靈敏度并同時(shí)保持或提高準(zhǔn)確性和精確度，而且因?yàn)橐韵氯齻€(gè)原因，ECL檢測(cè)方法80ng/mL的LLOQ已不適合支持下一階段的研究：
1 開發(fā)團(tuán)隊(duì)對(duì)該藥物在較低劑量下的半衰期特征感興趣，如果沿用目前的檢測(cè)方法，結(jié)果會(huì)
2 希望在受體占有率EC50為78ng/mL時(shí)測(cè)量循環(huán)中的藥物濃度；
3 在出現(xiàn)免疫原性的情況下，抗藥抗體可能對(duì)藥物有清除作用，降低循環(huán)中的藥物水平，所以推斷該檢測(cè)方法對(duì)較低劑量下的藥物定量會(huì)進(jìn)一步受限。
為了提高檢測(cè)靈敏度，將LLOQ拓展至所要求的30ng/mL，研究團(tuán)隊(duì)探索了采用Gyrolab®平臺(tái)和新試劑組合，在有限的時(shí)間內(nèi)快速開發(fā)新的檢測(cè)方法。
首先在Gyrolab®上對(duì)捕獲和檢測(cè)試劑組合進(jìn)行了篩選，以山羊多克隆抗藥抗體作為捕獲試劑，小鼠抗特別型單抗作為檢測(cè)試劑，這一組合顯示出最佳性能，捕獲抗體濃度為100µg/mL，檢測(cè)抗體濃度為2500ng/mL。使用Gyrolab® Bioaffy 200 CD(樣品體積200nL)和標(biāo)準(zhǔn)的Gyrolab®三步法(捕獲-分析物-檢測(cè))進(jìn)行分析, 樣品稀釋MRD為2。
PBS-T作為稀釋緩沖液(PBS + 1% BSA + 0.05% Tween-20)，樣品稀釋2倍。在3天內(nèi)進(jìn)行了6次CD測(cè)試。每張CD包括一條標(biāo)準(zhǔn)曲線和6個(gè)級(jí)別QC樣品的4個(gè)重復(fù)。標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍為30-2000ng/mL，錨點(diǎn)為2500ng/mL。QC樣品在100%人血清中稀釋125倍，然后用檢測(cè)緩沖液稀釋2倍，以使?jié)舛嚷湓跍y(cè)定范圍內(nèi)。表1顯示所有結(jié)果都有良好的檢測(cè)準(zhǔn)確度和精確度。
分別用PBS-T緩沖液和Gyros專利的Rexxip H緩沖液(Gyros)稀釋樣品進(jìn)行平行比較。 由于檢測(cè)方法中含有小鼠單抗，人抗鼠抗體HAMA是潛在干擾源，而Rexxip H緩沖液含有中和嗜異性抗體的成分，所以使用Rexxip H稀釋后應(yīng)能抑制基質(zhì)干擾信號(hào)。
20個(gè)血清樣本(10個(gè)正常人的血清NHS1-10，10個(gè)患病人群的血清DPS1-10)以30ng/mL的LLOQ濃度摻入藥物進(jìn)行分析，所有20個(gè)樣本也都進(jìn)行了未加標(biāo)的分析。驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)：80%的加標(biāo)樣品需要在標(biāo)稱濃度±25%的偏差范圍內(nèi)回收，所有未加標(biāo)樣品的回收必須低于LLOQ。結(jié)果(表2)顯示，正常人血清樣本使用Rexxip H緩沖液稀釋后符合目標(biāo)接受標(biāo)準(zhǔn)。正常人血清2號(hào)樣品，使用PBS-T的回收率為252.6%，使用Rexxip H的回收率在25%以內(nèi)，說明Rexxip H緩沖液非常好的消除了該樣本中的基質(zhì)干擾。其中兩個(gè)疾病血清樣本在未加標(biāo)樣時(shí)，即使使用Rexxip H緩沖液，其反算濃度為32~35ng/mL。因此，在對(duì)疾病人群的研究設(shè)計(jì)中，必須重復(fù)加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，將LLOQ設(shè)計(jì)為40ng/mL。
總結(jié)：
將電化學(xué)發(fā)光(ECL)檢測(cè)方法(LLOQ 80ng/mL)轉(zhuǎn)移到了Gyrolab®平臺(tái)上，使用優(yōu)化后的抗體對(duì)和緩沖液，產(chǎn)生了靈敏度更高的檢測(cè)結(jié)果，將LLOQ改進(jìn)至30ng/mL, 可以滿足未來(lái)研究的要求。
Gyrolab® 平臺(tái)的親和柱流穿模式以及專利的Rexxip 緩沖液可以最大程度的降低基質(zhì)效應(yīng)造成的數(shù)據(jù)準(zhǔn)確度和靈敏度的下降。
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參考文獻(xiàn)：
[1]. Selby C. Interference in immunoassay. Ann. Clin. Biochem. 36(Pt 6), 704–721 (1999).
[2]. Ana I. Barbosa, Nuno M. Reis. Antibody Surface Coverage Drives Matrix Interference in Microfluidic Capillary Immunoassays. ACS Sensors 2021 6 (7), 2682-2690.
[3]. Williams K, Erickson R, Fischer SK. Overcoming disease-specific matrix effect in a clinical pharmacokinetic assay using a microfluidic immunoassay technology. Bioanalysis, 9(16), 1207–1216 (2017).
[4]. Saloumeh K. Fischer. Ligand binding assay technologies: matching the right tool to your bioanalytical challenge. https://www.bioanalysis-zone.com.
[5]. Shannon D Chilewski. Addressing matrix effects in ligand-binding assays through the use of new reagents and technology.Bioanalysis (2014) 6(8), 1059–1067.
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