L-半乳糖酸-1,4-內酯脫氫酶（L-galactono-1,4-lactone dehydrogenase，Gal LDH）活性測定試劑盒說明書

分光光度法 50 管/48 樣

L-半乳糖酸1,4-內酯脫氫酶活性試劑盒抗壞

正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定測定意義：

L-半乳糖途徑是合成AsA 的主要途徑。Gal LDH 位于線粒體內膜，負責催化植物體內 AsA 生物合成的最后一步，也是該途徑的關鍵酶之一，對植物體內AsA 含量的積累起著至關重要的用。

測定原理：

Gal LDH 催化L-半乳糖內還原細胞se素c（Cyt c），還原型Cyt c 在 550nm 有吸收峰；測定還原型Cyt c 增加速率，來計算 Gal LDH 活性。

組成：

試劑二：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加入 40ml 蒸餾水，充分溶解。試劑三：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加入 5ml 蒸餾水，充分溶解。

自備儀器和用品：

臺式離心機、可見分光光度計、1ml 玻璃比色皿、可調式移液器、研缽、冰和蒸餾水。

粗酶液提取：

按照組織質量（g）：試劑一體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml 試劑一）進行冰浴勻漿。13000g，4℃離心 10min，取上清置冰上待測。

Gal LDH 測定操作：

分光光度計預熱 30 min，調節波長到 550nm，蒸餾水調零。

試劑二在 25℃水浴鍋中預熱 30 min。

依次在 1ml 玻璃比色皿中加入 100μl 上清液、800μl 預熱的試劑二和 100μl 試劑三，迅速混勻后于 550nm比色，記錄 10s 和 130s 的吸光值A1 和A2，△A = A2﹣A1。

Gal LDH 活性計算公式：

按蛋白濃度計算

Gal LDH 活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘還原 1nmol Cyt c 為 1 個酶活單位。

Gal LDH (nmol/min/mg prot) = △A÷ε÷d×V 反總×109÷（Cpr×V 樣）÷T

=289×△A ÷Cpr

按樣本質量計算

Gal LDH 活性單位定義：25℃中每克樣品每分鐘還原 1nmol Cyt c 為 1 個酶活單位。

Gal LDH (nmol/min/g 鮮重) = △A÷ε÷d×V 反總×109÷（W×V 樣÷V 樣總）÷T

=289×△A ÷W

ε：還原型Cyt c 摩爾消光系數，17.3×103L/ mol/cm；d：比色皿光徑(cm)，1cm；V 反總：反應體系總體積， 1ml=0.001 L；109：1mol=1×109nmol；V 樣：加入反應體系中上清液體積，100μl=0.1ml；Cpr：上清液蛋白濃度，mg/ml，蛋白質濃度需要另外測定，建議使用本公司蛋白質含量 BCA 試劑盒；V 樣總：加入提取液體積，1ml；W，樣本質量，g；T：反應時間，2min。

注意事項:

試劑二和試劑三配制好后 3 天內使用完。

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