一步克隆試劑盒

一步克隆試劑盒 克隆系列

產品貨號：CLO01

產品名稱：一步克隆試劑盒

產品規格：20T/10μL/T/50T/10μL/T

產品簡介：

NobleRyder® One Step Cloning Kit是一款簡單、快速、高效的DNA定向克隆技術，可以將插入片段定向克隆至任意載體的任意位點。可以高效兼容1-5個片段同源重組，50℃反應10 - 30 min即可進行連接，適用于快速克隆，DNA定點突變等。

實驗流程

1.制備線性化載體

選擇合適的克隆位點，并對載體進行線性化。盡量選擇無重復序列且載體克隆位點上下游20bp區域內GC含量在40%-60%之間的位點進行克隆。載體線性化方式有限制性內切酶酶切消化和反向PCR擴增。1）酶切制備線性化載體時，推薦使用雙酶切線性化，線性化wan全5.1 制備線性化載體

選擇合適的克隆位點，對載體進行線性化。選擇載體克隆位點附近無重復序列且上下游20bp區域內GC含量在40%-60%之間的位點進行克隆。

1）酶切制備線性化載體，推薦使用雙酶切方案；單酶切線性化并不影響無縫鏈接，但可能會有更多的環狀質粒殘留，增加后期克隆的篩選難度。

2）反向PCR擴增制備線性化載體，必須使用高保真DNA聚合酶進行載體擴增，以減少擴增突變的引入。PCR產物需要進行膠回收，減少環狀質粒環狀DNA模板的殘留。

2.制備插入片段

通過在插入片段正、反向引物5，端引入15-25bp線性化載體末端同源序列，使得插入片段PCR產物5，端和3，端的末端分別帶有與線性化載體的兩個末端對應的wan全一致的序列。使用高保真PCR Mix完成擴增，獲得PCR產物后進行瓊脂糖凝膠電泳分析，并回收正確的產物片段。

插入片段正向擴增引物設計方式：

5’-上游載體末端同源序列+酶切位點（保留或刪除）+基因特異性正向擴增引物序列-3’

插入片段反向擴增引物設計方式：

3’-基因特異性反向擴增引物序列+酶切位點（保留或刪除）+下游載體末端同源序列-5’

3.線性化載體與插入片段濃度測定

使用NanoDrop或Qubit檢測線性化載體和插入片段的濃度。

4.重組反應體系的配制

1）線性化載體和插入片段使用量計算

載體與插入片段摩爾比為1:2 ~ 1:3；當插入片段長度大于克隆載體時，將插入片段當作克隆載體，克隆載體當作插入片段計算。

2）在冰上配制反應體系：

3）使用移液器輕輕吸打混勻并瞬時離心。

4）50℃反應20min， 4℃維持或取出后置于冰上冷卻。

5）重組反應轉化、涂板，具體方法參照感受態細胞的說明書。

一步克隆試劑盒 克隆系列