異檸檬酸裂解酶（isocitrate lyase，ICL）試劑盒說明書

分光光度法 50 管/48 樣

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定測定意義：

ICL（EC4.1.3.1）主要存在于植物和微生物中，油料作物種子在萌發(fā)過程中，通過yi醛suan循h(huán)uan及其他過程將脂肪轉(zhuǎn)變成碳水化合物。ICL 是乙醛酸循環(huán)的關(guān)鍵酶之一。

測定原理：

ICL 催化異檸檬酸降解為乙醛酸和琥珀酸，乙醛酸和 NADH 在LDH 的作用下生成乙醇和NAD，NADH在 340nm 下有特征吸收峰，監(jiān)測 340nm 吸光度的減小速率可間接反應(yīng)ICL 活性。

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試劑組成和配制：

試劑三：粉劑×3 瓶，-20℃保存；臨用前每瓶加入 5ml 蒸餾水，充分混勻待用；用不完的試劑仍-20℃保存；

試劑四：粉劑×3 瓶，-20℃保存；臨用前每瓶加入 5ml 蒸餾水，充分混勻待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

試劑五：液體 800μl×2 支，4℃保存；臨用前每支加入 560μl 蒸餾水，充分混勻待用；用不完的試劑仍4℃保存；

試劑六：粉劑×3 瓶，4℃保存；臨用前每瓶加入 5ml 蒸餾水，充分混勻待用。用不完的試劑-20℃保存。

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說明書的參數(shù)為準(zhǔn)

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計、臺式離心機、水浴鍋、移液器、1ml 石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水

樣本的前處理：

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：

先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104 個）：提取液體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1ml 提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；15000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

2、組織：

按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。15000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

測定步驟：

1、分光光度計預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 570nm，蒸餾水調(diào)零。

2、加樣表(在 1.5ml 棕色EP 管中按下表依次加樣）：

混勻，37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）水浴 5min

將上述試劑按順序加入 1 ml 玻璃比色皿中，加試劑六的同時開始計時，在 340nm 波長下記錄 20 秒時的初始吸光度A1 和 2 分 20 秒時的吸光度A2，計算ΔA=A1-A2。

注意：

若一次性測定樣本較多，可將試劑一、二、三、四、五和樣本按比例配成混合液，在 37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）水浴 5min 以上，測定時加入 1220μl 混合液和 300μl 試劑六測定。

ICL 活性計算：

（1） 按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg 組織蛋白中每分鐘消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個酶活力單位。

ICL（nmol/min /mg prot）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=2443×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g 組織每分鐘消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個酶活力單位。

ICL（nmol/min /g 鮮重）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T=2443×ΔA÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算：

單位的定義：每 1 萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個酶活力單位。

ICL（nmol/min /104 cell）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T=4.886×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，1.52×10-3 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.05 ml；V 樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時間，2 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬。

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