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通過動態光散射分析培養基中的病毒顆粒
閱讀：29 發布時間：2025-6-6
介紹
傳統的視覺方法觀察溶液中病毒顆粒只能獲取極小樣本量的瞬時圖像，而基于動態光散射的顆粒分析技術則能獲得溶液中顆粒粒徑的整體平均值。目前，如何準確獲得實驗室培養病毒的顆粒粒徑數據是一項不小的挑戰，因為他們必須在含有白蛋白和其他小分子蛋白（如胎牛血清FBS或最低必需培養基MEM中的成分）的細胞培養基中增殖。當病毒顆粒從細胞中釋放出來時，體積較大的細胞碎片可通過離心分離，但培養基中的小分子蛋白質無法被去除。通過精確選擇動態光散射實驗的分布參數，即使在含有培養基中較小蛋白質的背景下，仍能準確分析出病毒顆粒的粒徑分布。
背景
魚類病毒
許多魚類病毒有可能對觀賞和經濟類魚類種群造成重大的經濟損失。本文將重點研究以下四種病毒類型，并附上各病毒科的典型結構示意圖：
1、CTV（割喉鱒病毒，一種新發病毒）
屬于海佩病毒科（Hepeviridae），為直徑25-35納米的小型球形病毒。（圖1）
2、IHNV（傳染性造血器官壞死病毒）
屬于彈狀病毒科（Rhabdoviridae），呈子彈形結構，尺寸約為寬70納米、長170納米，主要感染虹鱒魚和紅鮭魚。（圖2）
3、ISAV（傳染性鮭魚貧血病毒）
屬于正黏液病毒科（Orthomyxoviridae），病毒粒子直徑通常為50-120納米。該病毒多發于養殖的大西洋鮭魚群體中，致死率極高（圖3）。
4、LMBV（大口黑鱸病毒）
屬于虹彩病毒科（Iridoviridae），呈二十面體結構，直徑約150納米。目前主要分布于美國東南部的大口黑鱸種群中。（圖4）
圖1 圖2 圖3 圖4
我們希望在已知培養條件下快速檢測溶液中病毒顆粒的存在，并選擇動態光散射（DLS）來進行探索。
動態光散射儀器：
實驗方法
1、實驗樣品由美國華盛頓州西雅圖市美國地質調查局西部漁業研究中心（USGS Western Fisheries Research Center）友情提供。病毒顆粒在含有胎牛血清（FBS）的最低必需培養基（Minimum Essential Medium）中通過奇努克鮭魚胚胎細胞培養增殖，并釋放至培養基中。通過離心分離去除細胞及細胞碎片后，含有病毒顆粒的培養基保存于5°C冷藏環境中備用。
2、動態光散射（DLS）測量使用布魯克海文儀器公司（Brookhaven Instruments）的ZetaPALS型號儀器，該儀器配置了BI-MAS粒度測量附件。
3、實驗前，樣品在25°C的樣品艙中平衡至少5分鐘，隨后在聚苯乙烯比色皿中于25°C條件下進行測量。
4、DLS自相關數據通過NNLS反卷積算法處理，粒徑分布結果分別基于光強和數量分布進行統計，最終數據導出為Excel格式，并利用Origin 8.0軟件繪圖。
數據分析
分布曲線
非負最小二乘（NNLS）分布的統計權重可基于顆粒數量、表面積、體積或實測散射光強進行設定。其中，光強加權法會顯著放大溶液中大粒徑顆粒的權重，這是由于散射光強與粒徑呈冪次關系，如圖5所示；而數量加權法則更突出小粒徑顆粒的分布特征。
圖5
圖6
圖7
結果與討論
通過光強加權分布分析，結果明確顯示存在符合預期平均尺寸的病毒顆粒，圖6所示；但在數量分布中卻未檢測到這些顆粒，圖7所示。這表明病毒顆粒確實存在，但其數量相對培養基中的蛋白質及其他小分子顯著稀少。此外，數據中還存在其他大粒徑顆粒信號，可能來源于未被完全去除的細胞碎片或表達分子（如RNA、蛋白質）。這些物質因與病毒顆粒尺寸相近，可能在離心步驟中未被有效分離。通過設置合理的對照樣本，可進一步區分病毒顆粒與游離細胞碎片。