冰凍切片步驟

冰凍切片是一種在低溫條件下使組織快速冷凍到一定硬度，然后進行切片的方法，常用于臨床快速病理診斷。以下是基于最新信息的冰凍切片實驗步驟：

  1.組織取材：應盡可能快地采取新鮮的材料，以防止組織發生死后變化。

  2.組織速凍：將組織塊平放于軟塑瓶蓋或特制小盒內，如組織塊小可適量加OCT包埋劑浸沒組織，然后將特制小盒緩緩平放入盛有液氮的小杯內，使組織迅速冰結成塊。

  3.組織固定：樣品托上涂一層OCT包埋膠，將速凍組織置于其上，4℃冰箱預冷5-10分鐘讓OCT膠浸透組織。

  4.切片：將冷凍的樣品置于含OCT復合物的低溫冷箱中，采用標準的冷凍組織切片法。切片時，低溫室內溫度以-15℃至-20℃為宜，溫度過低組織易破碎。

  5.切片后處理：切好室溫放置30分鐘后，入4℃丙酮固定5-10分鐘，烘箱干燥20分鐘。PBS洗5分鐘×3次。

  6.染色：進行抗原熱修復，微波熱修復也可，室溫自然冷卻。可用3%H2O2孵育5-10分鐘，消除內源性過氧化物酶的活性。

  7.免疫熒光染色：冰凍切片室溫晾干15分鐘，用含10%正常山羊血清的PBS室溫封閉切片1小時，滴加適當比例稀釋的一抗或一抗工作液，室溫孵育2小時或4℃過夜。第二天回收一抗，切片置于染缸內，PBS洗5分鐘×3次，滴加二抗孵育，回收二抗后進行PBS洗，滴加DAPI工作液染核，室溫10-20分鐘后封片。

  8.切片保存：做好的切片放在切片盒內，置于4℃冰箱，可保存一周左右。

在進行冰凍切片實驗時，應注意組織的溫度平衡、切片機的設置、載玻片的準備以及切片后的固定和染色步驟。這些步驟的優化有助于獲得高質量的冰凍切片，從而提高診斷的準確性.