美國E+E細(xì)菌免疫傳感器準(zhǔn)確性的改進(jìn)
雞白痢沙門氏菌(Salmonella pullorum, S. pullorum)是雞白痢的病原體,雞白痢是引發(fā)雞發(fā)燒、下痢以及急性敗血癥等主要的傳染病。該病具有很高的傳染性,發(fā)病率和病死率。該病不僅對(duì)禽類養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失,更因污染禽類食品而嚴(yán)重威脅消費(fèi)者的身體健康。 檢測(cè)食品中食源性致病菌是預(yù)防、識(shí)別食源性疾病的關(guān)鍵。電化學(xué)免疫傳感器(Electrochemical Immunosensor)因其對(duì)于致病菌檢測(cè)具有高度的敏感性、快速簡便等優(yōu)點(diǎn)而備受關(guān)注,并得以迅速發(fā)展,迄今已有很多研究報(bào)道,但卻難以真正推廣應(yīng)用于實(shí)踐,究其存在的關(guān)鍵問題是重現(xiàn)性差而影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性,因此,研究此問題存在的原因并尋求解決的方法,從根本上改進(jìn)電化學(xué)免疫傳感器的性能,具有重要的意義,創(chuàng)新性顯著,應(yīng)用前景較大。

美國E+E細(xì)菌免疫傳感器準(zhǔn)確性的改進(jìn)        為進(jìn)一步改進(jìn)免疫傳感器的準(zhǔn)確性,在查閱大量資料和輔助參與研究的基礎(chǔ)上,①首先分析并找出造成重現(xiàn)性與準(zhǔn)確性不好的可能原因；②再有針對(duì)性的設(shè)計(jì)一組免疫傳感器進(jìn)行初步研究,通過檢測(cè)分析各種性能；③在此基礎(chǔ)上以不同修飾材料設(shè)計(jì)四組新型免疫傳感器,進(jìn)行對(duì)比研究,篩選出各項(xiàng)性能優(yōu)良的免疫電極組合,分析成因；④在上述研究分析的基礎(chǔ)上,又進(jìn)一步設(shè)計(jì)改進(jìn)免疫傳感器。本研究以S. pullorum為檢測(cè)目的菌,旨在為其它致病菌檢測(cè)提供研究模型,以促進(jìn)電化學(xué)免疫傳感器真正應(yīng)用于致病菌的實(shí)際檢驗(yàn)。 本研究主要有以下三部分： 1.基于電沉積石墨烯/聚乙烯醇/聚二甲基硅氧烷對(duì)電化學(xué)免疫傳感器穩(wěn)定性的改進(jìn) 以絲網(wǎng)印刷碳電極為檢測(cè)電極,通過電沉積氧化石墨烯并修飾聚乙烯醇(Polyvinyl alcohol, PVA)和聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane, PDMS)復(fù)合粘性材料,增強(qiáng)和增大與辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記二抗(羊抗兔抗體,HRP-labeled Goat Anti-Rabbit IgG)的結(jié)合牢固程度和結(jié)合量,提高免疫傳感器的準(zhǔn)確性和敏感性,孵育抗S. pullorum抗體,研制成新型免疫電極。傅里葉紅外光譜(Fourier Transformed Infrared Spectroscopy, FTIR)表征PVA-PDMS材料,以循環(huán)伏安法(Cyclic Voltammetry, CV)采集電化學(xué)反應(yīng)信號(hào),在優(yōu)化條件下,該免疫傳感器檢測(cè)S. pullorum的線性范圍為102-109cfu mL-1,檢出限為1.66×102cfu mL-1(S/N=3),儲(chǔ)藏穩(wěn)定性達(dá)到放置30d后電流值為初始值的94.73%,重現(xiàn)性RSD=5.47%(n=8),對(duì)實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果與國標(biāo)法的符合率達(dá)98.3%。不但具有一般免疫傳感器的簡便、快速、敏感、和經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn),而且具有很好的重現(xiàn)性、穩(wěn)定性和特異性,潛在應(yīng)用價(jià)值大。 2.四種快速檢測(cè)雞白痢沙門氏菌免疫傳感器的準(zhǔn)確性研究 電極修飾均一性和牢固性差會(huì)影響電化學(xué)免疫傳感器的重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性。為探求不同修飾電極的差異和規(guī)律來尋找改善方案,本研究選用絲網(wǎng)印刷電極(SPCE)為支持電極；通過電沉積方法修飾不同材料包括氧化石墨烯(GO)、納米金(AuNPs)、離子液體(ILs)制成4種免疫電極；修后的電極再與酶標(biāo)抗雞白痢抗體(HRP-Anti-S. pullorum)結(jié)合,用于雞白痢沙門氏菌(Salmonella pullorum)的快速檢測(cè)的；采用循環(huán)伏安法(CV)檢測(cè)不同電極的電化學(xué)響應(yīng)信號(hào)；分別進(jìn)行電極均一性、牢固性、靈敏度、特異性和穩(wěn)定性的對(duì)比試驗(yàn),綜合檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行擇優(yōu)篩選。結(jié)果表明,AuNPs和ILs對(duì)電極的各項(xiàng)性能特別是重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性有明顯改善作用,與其它組比較差異顯著,適用于快速檢測(cè)S. pullorum,實(shí)際推廣應(yīng)用前景好。 3.基于電沉積納米金／離子液體增強(qiáng)電化學(xué)免疫傳感器穩(wěn)定性研究 通過上述研究篩選得出,納米金(AuNPs)經(jīng)電沉積修飾電極,表現(xiàn)在均一性、敏感性、結(jié)合牢固度、生物相容性等方面都優(yōu)于其它材料,但在儲(chǔ)藏穩(wěn)定性方面有所欠缺；引入前述研究顯示儲(chǔ)藏穩(wěn)定性zui高的離子液體(ILs)共同修飾電極,以絲網(wǎng)印刷碳電極為檢測(cè)電極；電沉積修飾方法；依次修飾AuNPs,辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記抗體HRP-labeled Anti-S. pullorum與離子液體(ILs),結(jié)果表明抗體的結(jié)合牢固程度增大和結(jié)合量增加,免疫傳感器的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性有很大提高。同時(shí)與其他4中常見的免疫傳感器電極進(jìn)行各項(xiàng)對(duì)比研究,發(fā)現(xiàn)此快速檢測(cè)S. pullorum的新型免疫傳感器具有很好的重現(xiàn)性、穩(wěn)定性和特異性,潛在應(yīng)用價(jià)值大。