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在這種方法中，需合成一系列末端相互重疊的肽鏈，每段都對應于蛋白抗原線狀序列中的一小段，并將它們排列于固相上。用檢測抗體識別這些固相肽鏈，與之結合的特異性抗體，采用酶標記的二抗檢測。這種方法快速、成功率高。如果使用的抗體在免疫印跡反應中效果較好，此法所得結果清晰，并能識別那些耐變性的蛋白表位。在實際實驗中并非所有的抗體均能很好的反應，抗體僅對那些具有耐變性特性的蛋白質反應較好。
系列肽鏈的設計
如果時間和經費都允許，合適的肽鏈應該zui大可能地覆蓋所要作圖的表位（每段肽鏈15～20個氨基酸），而且每段肽鏈遞增1個氨基酸。這樣的系列將能對大多數抗體地作圖。因此，必須用500條肽鏈才能覆蓋具有500個氨基酸的蛋白質。較為實際的做法是設計15個氨基酸長，相互具有5個氨基酸重疊，或者20個氨基酸長，相互具有10個氨基酸重疊的系列肽鏈。如此則只需要100條15個氨基酸的肽鏈序列或者50條20個氨基酸的肽鏈序列。如果基因片段分析已經確定表位在100個氨基酸以內，那么，就應建立15—20個氨基酸的肽鏈庫。
系列肽鏈的設計
羧基末端的設計：如果要設計一套肽掃描系列，其中包括有該蛋白抗原的遠端羧基末端，設計2個較短的針對羧基端的肽鏈，因為某些抗體可以識別肽鏈游離的羧基。
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