1. 石蠟切片，步驟同前。切片經(jīng)貼片后，60℃烤片30min使蠟熔化，經(jīng)二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10min,脫蠟。然后，將切片放入100%、95%、90%、80%、70%乙醇中3-5min，再放入蒸餾水中3min，水化。

2．脫蠟和水化后，用PBS(pH7.4，具體看所用抗體及染色試劑說(shuō)明)沖洗3次，每次3分鐘。洗瓶沖洗。

3. 根據(jù)抗體的要求，對(duì)組織抗原進(jìn)行相應(yīng)的修復(fù)?？蛇x步驟，具體見(jiàn)抗體說(shuō)明書(shū)。

4.每張切片加1滴或50μl 3%過(guò)氧化氫，室溫下孵育10分鐘，以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。PBS沖洗3次，每次3分鐘。此步驟是對(duì)內(nèi)源性過(guò)氧化物酶含量高的組織而言。

4. 除去PBS液，每張切片加1滴或50μl的*抗體，室溫下孵育60分鐘或4℃放置一晚，具體參見(jiàn)每種抗體的說(shuō)明書(shū)。PBS沖洗3次，每次3分鐘。

5. 除去PBS液，每張切片加1滴或50μl 即用型MaxVisionTM 試劑或SP試劑，室溫下孵育10-15分鐘。PBS沖洗3次，每次3分鐘。

6. 除去PBS液，每張切片加2滴或100μl新鮮配制的DAB或AEC溶液，顯微鏡下觀察3-5分鐘（DAB）或37℃環(huán)境下10-30分鐘(AEC)。

7. 自來(lái)水沖洗，蘇木素復(fù)染10分鐘，PBS或自來(lái)水沖洗返藍(lán)。如果用DAB顯色，則切片經(jīng)過(guò)梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，步驟同H-E染色，中性樹(shù)膠封固；如果用AEC顯色，則切片不能經(jīng)酒精脫水，而直接用水性封片劑封片。