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有機溶劑能降低溶液的電解常數，從而增加蛋白質分子上不同電荷的引力，導致溶解度的降低；另外，有機溶劑與水的作用，能破壞蛋白質的水化膜，故蛋白質在一定濃度的有機溶劑中的溶解度差異而分離的方法，稱“有機溶劑分段沉淀法”，它常用于蛋白質或酶的提純。使用的有機溶劑多為乙醇和丙酮。
高濃度有機溶劑易引起蛋白質變性失活，操作必須在低溫下進行，并在加入有機溶劑時注意攪拌均勻以避免局部濃度過大。由此法析出的沉淀一般比鹽析容易過濾或離心沉降，分離后的蛋白質沉淀，應立即用水或緩沖液溶解，以降低有機溶劑濃度。
操作時的pH值大多數控制在待沉淀蛋白質的等電點附近，有機溶劑在中性鹽存在時能增加蛋白質的溶解度，減少變性，提高分離的效果，在有機溶劑中添加中性鹽的濃度為0.05mol/L左右，中性鹽過多不僅耗費有機溶劑，可能導致沉淀不好。
沉淀的條件一經確定，就必須嚴格控制，才能得到可重復的結果。有機溶劑濃度通常以有機溶劑和水容積比或用百分濃度表示。有機溶劑沉淀蛋白質分辨力比鹽析法好，溶劑易除去；缺點是易使酶和具有活性的蛋白質變性。故操作時要求條件比鹽析嚴格。對于某些敏感的酶和蛋白質，使用有機溶劑沉淀尤其要小心。
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