細菌氧化應激活性氧高質熒光測定試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

 細菌氧化應激活性氧高質熒光測定試劑是一種旨在通過透膜熒光染色劑氯甲基二氯二氫熒光素二乙酯，在細菌氧化條件下，產生熒光，來定量檢測細菌活性氧族的生成和增加的而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種實驗用細菌菌株氧化應激活性氧的分析。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡易，活體檢測，性能穩定，滯留持久，熒光清晰。

技術背景

細菌作為模式生物，是環境化學毒性研究的常用工具?；钚匝醯臋z測可以用于諸如多環芳烴化合物或重金屬的毒性作用以及修復（remediation）的評價指標。超氧自由基陰離子（superoxide radical；O2^-）、過氧化氫（hydrogen peroxide；H2O2）、羥自由基或氫氧基（hydroxyl radical；OH^-）、過氧化基（peroxyl radical；ROO^-）、氫過氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO^-）、過氧亞硝基陰離子（peroxynitrite anion；ONOO^-）次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、單線態氧氣（singlet oxygen）等細胞內活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的產生和增多，將導致細胞衰老或凋亡。氯甲基二氯二氫熒光素二乙酯（6-chloromethyl-2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate, acetyl ester；CM－H2DCFDA）是取代二氯二氫熒光素二乙酯（2´,7´-dichlorodihydrofluorescin diacetate；DCFH-DA）的升級產品，一種*自由通過細胞膜，并在細胞內長期滯留而不易外漏的染色劑。一旦被過氧化氫、羥自由基或氫氧基、過氧化基、次氯酸等氧化，便產生熒光。據此測定細菌活性氧族的濃度。

產品內容

 清理液（Reagent A）    200毫升

 染色液（Reagent B）    250微升

 稀釋液（Reagent C）     10毫升

 溶解液（Reagent D）      5毫升

產品說明書    1份

保存方式

保存 染色液（Reagent B）在－20℃冰箱里，嚴格避免光照；其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于染色的容器

微型臺式離心機：用于樣品操作

培養箱或恒溫水槽：用于染色孵育

200微升1厘米光徑比色皿或黑色96孔板：用于熒光定量分析

熒光分光光度儀或熒光酶標儀：用于熒光定量分析

實驗步驟

• 直接測定

• 準備好1毫升新鮮的待測菌液（OD600＝0.5；1 X 10⁸細胞/毫升）
• 移取200微升到1.5毫升離心管
• 加入5微升 染色液（Reagent B），混勻
• 轉移到200微升1厘米光徑比色皿或黑色96孔板
• 放進37℃熒光分光光度儀或熒光酶標儀檢測（激發波長490nm，散發波長530nm）：每隔5分鐘測讀一次，持續120分鐘――RFU增高，表明活性氧族（ROS）含量增高
• 構建活性氧和時間關系曲線

• 培養上清測定

• 準備好1毫升新鮮的待測菌液（OD600＝0.5；1 X 10⁸細胞/毫升）
• 移入到1.5毫升離心管
• 放進4℃微型臺式離心機離心10分鐘，速度為1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取200微升上清液到1.5毫升離心管
• 加入5微升 染色液（Reagent B），混勻
• 放進37℃培養箱里或恒溫水槽孵育30至60分鐘，避免光照
• 轉移到200微升1厘米光徑比色皿或黑色96孔板
• 放進37℃熒光分光光度儀或熒光酶標儀檢測（激發波長490nm，散發波長530nm）：――RFU增高，表明活性氧族（ROS）含量增高

三、細菌內測定

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的 染色液（Reagent B）置入冰槽里融化。然后移出5微升 染色液（Reagent B）到新的1.5毫升離心管，加入200微升 稀釋液（Reagent C），混勻后，標記為 染色工作液，置入冰槽里。然后進行下列操作。

• 準備好1毫升新鮮的待測菌液（OD600＝0.5；1 X 10⁸細胞/毫升）
• 移入到1.5毫升離心管
• 放進4℃微型臺式離心機離心10分鐘，速度為1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 加入1毫升預冷的 清理液（Reagent A），混勻
• 放進微型臺式離心機離心10分鐘，速度為1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 重復實驗步驟5至7一次
• 加入200微升含有 染色液（Reagent B）和 稀釋液（Reagent C）的 染色工作液，混勻
• 放進37℃培養箱里或恒溫水槽孵育30分鐘，避免光照
• 放進微型臺式離心機離心10分鐘，速度為1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 加入1毫升預冷的 清理液（Reagent A），混勻
• 放進微型臺式離心機離心10分鐘，速度為1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 加入100微升預冷的 清理液（Reagent A），混勻
• 加入100微升 溶解液（Reagent D）
• 上下傾倒混勻數次
• 轉移到200微升1厘米光徑比色皿或黑色96孔板
• 放進37℃熒光分光光度儀或熒光酶標儀檢測（激發波長490nm，散發波長530nm）：――RFU增高，表明活性氧族（ROS）含量增高
• 或每隔5分鐘測讀一次，持續30分鐘――RFU增高，表明活性氧族（ROS）含量增高
• 構建活性氧和時間關系曲線

注意事項

• 本產品為50次操作
• 操作時，須戴手套
• 操作時，避免污染母液
• 建議染色完成后，即刻進行熒光檢測分析
• 孵育時，必須避免光照
• 本產品染色劑不易洗掉，染色持久
• 根據不同菌株類型，可以調整 染色工作液的使用劑量（1：100至1：1000容量比），避免過度染色
• 本公司提供陽性對照甲萘醌溶液（GMS12041），觀察細胞熒光增強現象
• 本公司同時提供 細菌細胞內活性氧初級熒光測定試劑盒（GMS10016.14），滿足不同用戶需求
• 本公司提供系列活性氧分析試劑產品

質量標準

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定熒光清晰