ATCC細(xì)胞實(shí)驗(yàn)用品

材料：貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞

器材：24孔培養(yǎng)孔板、吸管、膠帽、離心管、培養(yǎng)皿、半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙、蓋玻片、細(xì)胞計(jì)數(shù)板、酒精棉球、酒精燈、離心機(jī)、倒置顯微鏡、普通光學(xué)顯微鏡、超凈工作臺(tái)、CO2培養(yǎng)箱

試劑：Hanks液、DMEM培養(yǎng)基(含10％小牛血清)、0. 25％胰蛋白酶消化液、吉姆薩染液

實(shí)驗(yàn)步驟

(1)消化：用0．25％胰蛋白酶溶液消化處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的單層培養(yǎng)細(xì)胞，收集消化的細(xì)胞于10 ml離心管中。

(2)離心：500～1000r／min離心5min，棄上清。

(3)加入DMEM培養(yǎng)基(含10％小牛血清)，制備單細(xì)胞懸液。

(4)計(jì)數(shù)：吹打均勻后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

(5)按2×104～5×104個(gè)／ml的ATCC細(xì)胞密度接種在24孔培養(yǎng)孔板內(nèi)。

(6)每天用胰蛋白酶溶液對(duì)其中3孔細(xì)胞進(jìn)行消化，鏡下計(jì)數(shù)。

(7)計(jì)算3孔培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)的平均值(細(xì)胞數(shù)／ml)。

(8)連續(xù)7天按上述方法消化3孔細(xì)胞并進(jìn)行計(jì)數(shù)，算平均值。

(9)以培養(yǎng)時(shí)間作為橫坐標(biāo)、細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)，在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上，將各點(diǎn)連成曲線，即可獲得細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線(圖5-1)。

結(jié)果分析

培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線在正常情況下通常呈s形，觀察曲線可發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)初期(1～2天)的細(xì)胞數(shù)約呈下降趨勢(shì)，這段時(shí)期即為細(xì)胞滯留期(潛伏期)。滯留期之后的3～5天，細(xì)胞數(shù)增加顯著，呈對(duì)數(shù)增長(zhǎng)的趨勢(shì)，此時(shí)細(xì)胞進(jìn)入了對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。當(dāng)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞數(shù)達(dá)到高峰，細(xì)胞生長(zhǎng)逐漸停止，細(xì)胞數(shù)量進(jìn)入穩(wěn)定狀態(tài)，此時(shí)即為平臺(tái)期(平頂期)。

注意事項(xiàng)

在進(jìn)行生長(zhǎng)曲線的測(cè)定時(shí)，接種到培養(yǎng)板孔中的細(xì)胞數(shù)量應(yīng)保持每孔一致。接種量應(yīng)適當(dāng)，不能過(guò)少或過(guò)多，過(guò)少將使細(xì)胞生長(zhǎng)周期延長(zhǎng)，過(guò)多將導(dǎo)致細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)未完成前即需傳代，這兩種情況下所得到的生長(zhǎng)曲線均不能較準(zhǔn)確地反應(yīng)ATCC細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況。