純化線粒體呼吸控制率（RCR）定量檢測試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

 純化線粒體呼吸控制率（RCR）定量檢測試劑是一種旨在通過極譜法檢測系統（polarographic system）測定新鮮活體線粒體在ADP存在（III態呼吸）與否（IV態呼吸）的情況下溶解氧（dissolved oxygen）的消耗差異，即呼吸控制率（RCR），以評價線粒體結構和功能完整性以及氧化磷酸化效率的而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。可以被用于線粒體生理功能和藥物作用機制等的研究。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡易，活體檢測，性能穩定。

技術背景

線粒體是細胞呼吸鏈和氧化磷酸化的中心。電子傳遞和ATP合成通過質子梯度偶聯成一體。線粒體結構完整，功能正常，底物充分，電子傳遞形成的質子梯度不斷被消耗，電子得以順暢傳遞，氧氣快速消耗，其耗氧率大，為III態呼吸。ADP耗竭，質子梯度不能消耗，阻礙電子傳遞，氧氣消耗減少，為IV態呼吸。 呼吸控制率（respiratory control ratio或respiratory control index；RCR），又稱呼吸調節比，是指III態（加入ADP）的呼吸速率與IV態（ADP耗竭）的呼吸速率之比。正常線粒體的RCR為3至10：RCR降低意味著線粒體ATP合成功能損傷，呼吸障礙；RCR增高意味著細胞活動旺盛，代謝加快。

產品內容

 介質液（Reagent A）      50毫升

  IV態底物液（Reagent B）     400微升

  III態底物液（Reagent C）     400微升

產品說明書  1份

保存方式

保存在－20℃冰箱里，有效保證6月

用戶自備

CLARK氧電極儀：用于測定溶解氧濃度

實驗步驟

實驗開始前，制備好新鮮的線粒體置于冰槽里備用；同時將－20℃冰箱里的試劑融化，并預熱氧電極儀到25℃。然后進行下列操作。

• 加入2.5毫升 介質液（Reagent A）到反應玻璃槽
• 使用微型磁力子攪拌，充分混勻
• 密封反應槽
• 開始記錄氧濃度：起始飽和氧濃度值為0.240微摩爾分子氧/毫升（25℃）
• 持續記錄1分鐘后，注射加入20微升待測的線粒體（總量2毫克）（注意：氧濃度可能瞬時變化）
• 持續記錄1分鐘后，注射加入20微升  IV態底物液（Reagent B）――開始IV態呼吸（注意：參見注意事項9）
• 持續記錄2分鐘：出現氧濃度緩慢下降
• 繼續注射加入20微升  III態底物液（Reagent C）（注意：氧濃度在10秒鐘內開始下滑）――開始III態呼吸（注意：參見注意事項9）
• 持續記錄直至出現線性下行斜線出現拐點
• 分別測算III態呼吸速率和IV態呼吸速率：氧濃度降低值÷實際時間（分鐘）
• 計算呼吸控制率：III態呼吸速率÷IV態呼吸速率

注意事項

• 本產品為20次操作
• 操作時，須戴手套
• 確保反應玻璃槽潔凈，密閉，以免氧氣流入
• 線粒體樣品須新鮮制備，建議不要凍存；制備的線粒體膜須完整，非常重要；建議使用 線粒體分離試劑盒－GMS10006.1
• 注射加入反應槽時，避免氣泡和空氣注入
• 避免乙醇污染；乙醇增加氧濃度；如果底物或抑制劑須使用乙醇溶解，則加注10微升
• 保持反應槽溫度恒定，溫度降低，氧濃度升高
• 反應液充分混勻，和環境氧保持平衡
• 加注  IV態底物液（Reagent B）和  III態底物液（Reagent C）前，須充分凍融和混勻
• 嚴格按照規定加注試劑，切莫增加加注試劑容量
• 本公司提供系列線粒體檢測試劑產品

質量標準

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定檢測敏感