植物氧化應激活性氧超氧陰離子比色法定量檢測試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

 植物氧化應激活性氧超氧陰離子比色法定量檢測試劑是一種旨在通過硝基藍四氮唑染料，受到超氧陰離子O₂^-的還原，產生不溶性藍黑*素沉淀，由分光光度儀比色分析，定量檢測樣品超氧陰離子活性氧族的生成和增加的的而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種新鮮的植物組織（葉片、谷粒、種子等）等的超氧陰離子檢測?？梢员挥糜诩毎蛲觥⑿盘杺鬟f、衰老、代謝和營養學等的研究。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定，檢測敏感。

技術背景

超氧自由基陰離子（superoxide radical；O^2-）、過氧化氫（hydrogen peroxide；H₂O₂）、羥自由基或氫氧基（hydroxyl radical；OH^-）、過氧化基（peroxyl radical；ROO^-）、氫過氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO^-）、過氧亞硝基陰離子（peroxynitrite anion；ONOO^-）次氯酸（hypochlorous acid；HClO）、半醌自由基（semiquinone radical）、單線態氧氣（singlet oxygen）等細胞內活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的產生和增多，將導致細胞衰老或凋亡。染料四氮唑蘭（tetrazolium）化合物，包括硝基藍四氮唑（Nitro Blue Tetrazolium；NBT）和二甲基噻唑二苯基四唑嗅藍（3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide；MTT），一旦受到超氧陰離子O₂^-的直接還原，便產生不溶性藍黑色甲暨色素，在分光光度儀下（540nm波長），呈現吸光峰值的變化。據此定量檢測植物組織細胞內超氧陰離子活性氧族的濃度。  

產品內容

 清理液（Reagent A） 120毫升

 裂解液（Reagent B）  20毫升

 緩沖液（Reagent C）  20毫升

 反應液（Reagent D）     2毫升

 陰性液（Reagent E）     1毫升

產品說明書      1份

保存方式

保存 清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在-20℃冰箱里； 反應液（Reagent D）避免光照；有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于樣品制備和保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

DOUNCE勻漿器：用于裂解植物組織

（微型）臺式離心機：用于樣品操作

培養箱：用于反應孵育

比色皿或酶標板：用于比色分析的容器

分光光度儀或酶標儀：用于比色分析

實驗步驟

• 樣品準備

• 準備好新鮮的植物組織（葉片、谷粒、種子等），并秤重以確定500毫克組織重量 
• （選擇步驟）放進預冷的15毫升錐形離心管
• （選擇步驟）加入3毫升 清理液（Reagent A）清洗1次
• 即刻用刀片切碎組織
• 放進一個預冷的15毫升錐形離心管
• 加入預冷的1毫升 裂解液（Reagent B）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 即刻放進預冷的DOUNCE勻漿器，在冰槽里用研磨棒勻化組織（約80下）
• 將所有組織勻漿物移入1.5毫升離心管，放進4℃微型臺式離心機離心10分鐘，速度為5000g（或7500RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移出上清液（注意：不要觸碰沉淀物）到另一個新的預冷的15毫升錐形離心管
• （選擇步驟）如果上清液含有肉眼可見的殘渣，重復離心5分鐘一次，速度為5000g（或7500RPM，例如eppendorf 5415）
• 即刻移入到1.5毫升離心管
• 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用  Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－GMS30030.1）
• 放進－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里備用

• 測定準備

• 開啟并設定好分光光度儀（溫度為37℃）：波長540nm，并置零
• 從－20℃冰箱里取出試劑，置于冰槽里融化； 反應液（Reagent D）避免光照
•  緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度

• 背景對照測定

• 移取800微升 緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入100微升 陰性液（Reagent E）
• 加入100微升 反應液（Reagent D）
• 上下傾倒數次，混勻
• 在37℃溫度下孵育60分鐘
• 即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照

• 樣品測定

• 移取800微升 緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入100微升待測樣品（50微克蛋白）（注意：樣品須清澈）
• 加入100微升 反應液（Reagent D）
• 上下傾倒數次，混勻
• 在37℃溫度下孵育60分鐘
• 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品讀數

五、計算樣品濃度

[（樣品讀數－背景讀數）X 1 （體系容量；毫升）X樣品稀釋倍數]÷[0.1（樣品容量；毫升）X 7.2（毫摩爾吸光系數）]＝微摩爾O^2-/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝微摩爾O^2-/毫克

• 酶標板測定

• 在96孔酶標板上做好相應標記：背景對照和樣品
• 分別移取200微升 緩沖液（Reagent C）到96孔板的所有孔中
• 分別加入25微升 陰性液（Reagent E）或待測樣品（20微克蛋白）到相應孔中（注意：樣品須清澈）
• 分別加入25微升 反應液（Reagent D）到96孔板的所有孔中
• 輕輕搖動96孔酶標板
• 在37℃溫度下孵育60分鐘
• 即刻放進酶標儀檢測：獲得吸光讀數
• 濃度計算：

[（樣品讀數－背景讀數）X 0.25 （體系容量；毫升）X樣品稀釋倍數]÷[0.025（樣品容量；毫升）X 7.2（毫摩爾吸光系數）X 0.6（光徑距離；厘米）]＝微摩爾O^2-/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝微摩爾O^2-/毫克

注意事項

• 本產品為20次（比色皿）或80次（酶標板）操作
• 操作時，須戴手套
• 孵育時，避免光照
• 系統操作過程中，背景測定只需1次
• 建議使用比色皿測定
• 樣品須澄清，至關重要
• 測定值由低到高變化
• 比色測定后，比色皿須清洗*
• 如果超氧陰離子活性氧濃度過低，可以延長孵育時間至4小時
• 建議待測樣本蛋白濃度為50微克/100微升；如果樣本濃度過低或過高， 則可以增加或降低樣本量（本公司提供   Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－GMS30030.1）
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調整樣品濃度
• 本公司提供系列活性氧檢測試劑產品 

質量標準

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定檢測敏感