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疏水色譜是利用樣品分子與固定相的疏水力作用的不同，用流動相洗脫時，各組分遷移速度不同而達到分離的目的，主要分離對象是蛋白質。疏水作用色譜固定相的非極性比較弱，流動相多采用高濃度鹽緩沖液進行梯度洗脫。溫和的分離條件，可以避免反相色譜中由于固定相較強的疏水性和有機流動相引起蛋白質的不可逆吸附和變性，因此特別適用于活性物質的分離與純化。
疏水色譜的幾個影響因素介紹：
1、鹽類和鹽組成
鹽的摩爾表面張力增大，蛋白質在疏水層析柱內的吸附能力相應增大。各種鹽離子和離子對具有破壞周圍水分子有序排列的能力。 流動相中鹽的組成對蛋白質在疏水層析介質上的吸附能力具有zui為重大的影響。選擇合適的鹽對保證蛋白質的分離以及分離后蛋白質的活性都很重要。
2、離子強度
離子強度的大小直接影響樣品組分在固定相的保留值。一般增加離子強度來增加組分的保留值，降低離子強度來提高組分的解析附能力。
3、溶液的酸堿度
溶液的pH值主要考慮能維持生物大分子生物活性的pH環境。一般情況，溶液的pH接近蛋白質的等電點，其疏水性增加，有利于與固定相配基相互作用；遠離其等電點，其疏水性減少，不利于與固定相配基結合，但有利于蛋白質洗脫。因此通過改變溶液的pH也可以改變蛋白質的疏水性。
4、柱溫
一般柱溫升高，生物大分子的構象會發生變化，疏水作用增加，吸附能力增加，有利于提高層析柱的分離度，所以有時可以通過提高柱溫來增加疏水基團與配基間的相互作用，分離性質相近的化合物，如對分離一些小分子是非常有效的。但是對于具有生物活性的物質或酶類，在高溫條件下易變性失活，因此不宜在高溫條件下進行分離。一般都在常溫或低溫下操作。
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