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轉化細胞外源基因導入的原理和操作步驟

來源:上海谷研實業有限公司   2018年03月29日 15:44  

轉化細胞實驗試劑
1. 細胞營養液(DMEM液體培養基,10%胎牛血清,雙抗100單位/ml),消化液(0.05%胰酶,0.53mM EDTA·Na),Hank’s液。
2. 2×HBS液(280mMNaCl, 10mMKCl, 1.5mMNaHPO4·2H2O, 12mM葡萄糖,50mMHepes,pH7.05, 0.2μ過濾除菌),CaCl2(2.5M,0.2μ過濾除菌)溶液,超純水(滅菌)。
3. PBS,蛋白酶K,NP40,RNaseA,無水乙醇,酚,DNA上樣緩沖液,瓊脂糖,TAE電泳緩沖液,EB。
實驗設備
1. 10cm細胞培養皿
2. 50ml、15ml一次性離心管
3. 10ml玻璃吸管(滅菌),與玻璃吸管配套的吸球及膠管
4. 二氧化碳培養箱
5. 倒置顯微鏡
6. 20μl,200μl微量移液器
7. 1.5ml離心管(滅菌)
8. 200μl微量移液器頭
9. 1ml微量移液器
10. 低速臺式離心機
11. 高速臺式離心機
12. 4°C,-20°C冰箱
13. DNA凝膠電泳設備
14. 紫外凝膠成像儀
實驗材料
胚腎細胞系293,TNF-R1哺乳動物細胞表達質粒(CsCl超速離心純),哺乳動物細胞表達載體(CsCl超速離心純)。
實驗步驟
1. 293細胞的傳代培養(*天) 
   1) 顯微鏡觀察母細胞的生長狀態,確定傳代比例。 
為了獲得較高的轉染效率,必需保證細胞處于合適的生長密度,因此應根據母細胞的生長密度調整傳代比例。磷酸鈣轉染的合適細胞密度為50%-70%,本實驗中使用的293細胞長成致密單層后一般按照1:6傳代即可。 
   2) 在酒精燈旁打開培養皿蓋,倒去皿中的細胞營養液,加入2mlHank’s液,輕輕搖動,將溶液倒出。 
   3) 消化與分裝。 
在培養皿中加入1ml消化液(0.53mMEDTA, 0.05%胰蛋白酶液),37°C靜置5分鐘左右,顯微鏡觀察,如果細胞變圓且彼此分離表明消化*,此時可加入10ml營養液終止消化,吹打數次,使培養皿壁上的細胞全部脫落下來,并分散形成均勻的細胞懸液。按照傳代的比例補加適當體積的營養液,吹打混勻后分裝到新的培養皿中。 
在分裝好的細胞培養皿上做好標記,置于37°C二氧化碳培養箱中培養。 
2. 用磷酸鈣介導的外源質粒轉染法在293細胞中過量表達TNF-R1(第二天) 
   1) 顯微鏡觀察待轉染細胞的生長狀態 
      a. 觀察細胞是否污染 
      b. 觀察培養液顏色的變化 
      c. 觀察細胞的生長密度 
   2) 轉染 
      a. 用微量移液器在1.5ml離心管中依次加入10μg(1μg /μl, 10μl)質粒DNA(實驗組為TNF-R1的哺乳動物細胞表達載體,對照組為空載體),350μl超純水,40μlCaCl2(2.5M)溶液,混勻。 
      b. 在另一1.5ml離心管中加入400μl2×HBS,將A液分三次緩慢加入,每次加入A液后用吹氣泡的方法混勻。室溫靜置5分鐘。 
      c. 將A,B混合液均勻地滴加在待轉染的293細胞培養液中,輕輕晃動使混勻。將培養皿置于37°C二氧化碳培養箱中。 
3. 轉化細胞的形態觀察,“DNA Ladder”的提取及瓊脂糖電泳分析(第三天) 
   1) 顯微鏡觀察過量表達TNF-R1(實驗組)和空載體(對照組)的293細胞形態上的差異。 
   2) 用10ml玻璃吸管將實驗組和對照組培養皿中的細胞輕輕吹打下來,收集到15ml離心管中,2000rpm離心5分鐘,沉淀用1mlPBS重懸,轉移到1.5ml離心管中,2000rpm離心3分鐘,去除上清液,加入200μlPBS(0.2mg/ml 蛋白酶 K),重懸細胞,再加入200μlPBS(2%NP40),顛倒混勻,4°C作用30分鐘,期間顛倒數次。12,000rpm離心2分鐘,吸出上清,加入1ml乙醇,顛倒混勻,-20°C靜置10分鐘,12,000rpm離心10分鐘,沉淀溶于50μl水中,加入RNaseA(10mg/ml),37°C靜置20分鐘。 
   3) 在DNA溶液中加入10μlDNA上樣緩沖液,取出50μl進行2%瓊脂糖凝膠電泳,紫外凝膠成像儀拍照。
含量測定    100mg    130568-200501    莫匹羅星
含量測定    100mg    130569-200601    替卡西林
紅外鑒別    100mg    130570-200501    磷霉素鈉
含量測定    200mg    130572-200701    頭孢西丁
鑒別    50mg    130573-200701    1,3-萘二酚
有關物質    50mg    130576-200901    克林霉素B
有關物質    100mg    130579-200901    反式頭孢吡肟
HPLC含量    100mg    130585-201001    巴洛沙星
有關物質    50mg    130601-201001    環丙沙星雜質B
有關物質    50mg    130605-201001    環丙沙星雜質Ⅰ
有關物質    50mg    130650-200901    阿奇霉素雜質J
轉化細胞

 

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