ELISA試劑盒酶標記抗體方法主要有兩種：戊二醛交聯法和過碘酸鹽氧化法。
1、戊二醛交聯法：
   戊二醛是一種雙功能團試劑，它可以使酶與蛋白質的氨基通過它而聯接。堿性磷酸一般用此法進行標記。交聯方法分一步法、兩步法兩種。在一步法中戊二醛直接加入酶與抗體的混合物中，反應后既得酶標記抗體。
   ELISA試劑盒中常用的酶一般都用此法交聯。它具有操作簡便、有效（結合率達60%~70%）和重復性好等優點。缺點是交聯反應是隨機的，酶與抗體交聯時分子間的比例不嚴格，結合物的大小也不均一，酶與酶，抗體與抗體之間也有可能交聯，影響效果。在兩步法中，先將酶與戊二醛作用，透析除去多余的戊二醛后，再與抗體作用而形成酶標抗體。也可先將抗體與戊二醛作用，再與酶聯結。兩步法的產物中絕大部分的酶與蛋白質是以1:1的比例結合的，較一步法的酶結合物更有助于本底的改善以提高敏感度，但其偶聯的有效率較一步法低。
2、過碘酸鹽氧化法：
   本法只適用于含糖量較高的酶。辣根過氧化物酶的標記常用此法。反應時，過碘酸鈉將HRP分子表面的多糖氧化為醛基很活潑，可與蛋白質上的氨基形成Schiff氏堿而結合。酶標記物按克分子比例聯結，其*比例為：酶：抗體=1~2：1。此法簡便有效，一般認為是HRPzui可取的標記方法，但也有人認為所有試劑較為強烈，各批實驗結果不易重演。
   按以上方法制備的酶結合物一般都混有未結合物的酶和抗體。理論上，結合物中混有的游離酶一般不影響ELISA試劑盒中zui后的酶活性測定，因經過*洗滌，游離酶可被除去，并不影響zui終的顯色。但游離的抗體則不同，它會與酶標抗體競爭相應的固相抗原，從而減少了結合到固相上的酶標抗體的量。因此制備的酶結合物應予純化，去除游離的酶和抗體后用于檢測，效果更好。
   結合物制得后，在用作ELISA試劑盒前尚需確定其適當的工作濃度。使用過濃的結合物，既不經濟，又可使本底增高；結合物的濃度過低，則又影響檢測的敏感性。所以必須對結合物的濃度予以選擇。zui適的工作濃度就是指結合物稀釋至一定濃度時，能維護一個低的本底，并獲得測定的*靈敏度，達到zui合適的測定條件和測定費用的節省。就酶標抗體本身而言，它的有效工作濃度是指與其相應抗原包被的載體作試驗時，能得到陽性反應的zui高稀釋度。