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細胞胱硫醚-β-合成酶(Cystathionine-β-s

來源:上海銘博生物科技有限公司   2018年05月22日 11:58  

 

 細胞胱硫醚-β-合成酶Cystathionine-β-synthase;CBS)活性酶連續循環光譜法定量檢測試劑盒產品說明書(中文版)

 

主要用途

 

 細胞胱硫醚-β-合成酶Cystathionine-β-synthase;CBS)活性酶連續循環光譜法定量檢測試劑是一種旨在使用胱硫醚-β-合成酶、賴氨酸脫羧酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和蘋果酸脫氫酶連續循環法反應系統中,伴隨的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH)的氧化反應, 即采用光譜法測定其氧化后峰值(NADH濃度的變化,以此進行測算單位酶活性的而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適合于各種動物和人體細胞裂解懸液胱硫醚-β-合成的活性檢測。產品不含污染性蛋白酶,嚴格無菌,即到即用,操作簡捷,性能穩定,反應優化,檢測敏感。

 

技術背景

 

胱硫醚-β-合成酶(Cystathionine-β-synthase;CBS;EC4.2.1.22),又稱為β-硫解酶(β-thiolase)或半胱氨酸合成酶(cysteine synthase),屬于水解酶(hydrolyase)家屬中的一員作用于硫代謝中轉硫通路(transsulfuration pathway)或胱氨酸(cysteine)代謝的*步。在輔因子磷酸吡哆醛(Pyridoxal Phosphate)和S-腺苷蛋氨酸(S-adenosyl-L-methionine;adoMet)的幫助下,催化將同型胱氨酸(homocysteine)轉化為胱硫醚(cystathionine)的反應。人體胱硫醚-β-合成酶為四體蛋白,551氨基酸。但心臟、肺、睪丸、脾臟不具有胱硫醚-β-合成酶活性。其基因突變引起胱硫醚-β-合成酶缺失,將導致高胱氨酸尿癥(homocystinuria),一種高同型半胱氨酸血癥(hyperhomocysteinemia;HHC);而胱硫醚-β-合成酶異常高度表達,為唐氏綜合癥的特征之一。 基于底物絲氨酸(serine)和半胱氨(cysteamine), 受到胱硫醚-β-合成酶的水解,進而通過賴氨酸脫羧酶(Lysine decarboxylase;LDC、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶phosphoenolpyruvate carboxylase;PEPC)和蘋果酸酸脫氫酶(malate dehydrogenase;MDH)反應系統中,由還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotide;NADH)轉化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide;NAD),所產生的峰值變化(340nm),來定量分析胱硫醚-β-合成酶的活性。其反應系統為:

 

 

 

產品內容

 

 清理液(Reagent A) 毫升

 裂解液(Reagent B)      毫升

 緩沖液(Reagent C) 毫升

 酶促液(Reagent D)      微升

 反應液(Reagent E)      微升

 底物液(Reagent F) 微升

 陰性液(Reagent G)   微升

產品說明書    1份

 

保存方式

 

保存 清理液(Reagent A)在4冰箱里,其余的保存在-20冰箱里,避免反復凍融; 底物液(Reagent F),避免光照,有效保證6

 

用戶自備

 

15毫升錐形離心管:用于樣品制備的容器

1.5毫升離心管:用于樣品制備和保存的容器

細胞刮脫棒:用于細胞脫離

微型臺式離心機:用于樣品制備

培養箱:用于反應孵育

200微升1厘米光徑比色皿或96孔板:用于光譜分析的容器

分光光度儀或酶標儀:用于光譜分析

 

實驗步驟

 

實驗開始前,將-20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液置入冰槽里融化; 底物液(Reagent F注意避光 緩沖液(Reagent C)室溫下預熱。然后進行下列操作。

 

  • 樣品準備

 

  • 準備好25cm2細胞培養瓶或60mm細胞培養皿的待測培養細胞(15 X 106細胞)
  • 小心加入xx毫升 清理液(Reagent A,覆蓋生長表面
  • 小心抽去清理液
  • 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞(注意:可以使用胰酶消化
  • 加入xx毫升 清理液(Reagent A,混勻細胞
  • 移入到預冷的15毫升錐形離心管(注意:懸浮細胞從這一步驟開始
  • 放進4℃臺式離心機離心5分鐘,速度為300g
  • 小心抽去上清液
  • 加入xx微升 裂解液(Reagent B,充分混勻
  • 轉移到預冷的1.5毫升離心管
  • 強力渦旋震蕩15
  • 置于冰槽里孵育30分鐘
  • 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘,速度為16000g(或13000RPM,例如eppendorf 5415
  • 小心移取500微升上清液到新的預冷的1.5毫升離心管
  • 移取10微升進行蛋白定量檢測(注意:建議使用  Bradford蛋白質濃度定量試劑盒-GMS30030.1
  • 即刻放進-70保存或置于冰槽里繼續后續操作

 

二、測定準備

 

  • 準備好上述待測樣品,置于冰槽里 
  • 設定好分光光度儀(溫度為37℃):波長為340nm,間隔2分鐘,讀數6次(共10分鐘),并置零
  •  緩沖液(Reagent C室溫下均衡溫度

 

  • 背景對照測定

 

  • 移取xx微升 緩沖液(Reagent C到新的比色皿
  • 加入xx微升 酶促液(Reagent D
  • 加入xx微升 反應液(Reagent E
  • 加入xx微升 底物液(Reagent F
  • 放進37培養箱里靜置3分鐘
  • 加入xx微升 陰性液(Reagent G
  • 上下傾倒數次,混勻(限定在3秒之內)
  • 即刻放進分光光度儀檢測,此為背景空對照:340波長讀數0分鐘 340波長讀數10分鐘

 

  • 樣品活性測定

 

  • 移取xx微升 緩沖液(Reagent C到新的比色皿
  • 加入xx微升 酶促液(Reagent D
  • 加入xx微升 反應液(Reagent E
  • 加入xx微升 底物液(Reagent F
  • 放進37培養箱里靜置3分鐘
  • 加入10微升待測樣品(注意:100微克蛋白;樣品須溶解
  • 上下傾倒數次,混勻(限定在3秒之內)
  • 即刻放進分光光度儀檢測,此為樣品總活性讀數:340波長讀數0分鐘 340波長讀數10分鐘

 

  • 計算樣品活性

 

  • 酶標儀測定

 

  • 96孔板上做好相應標記:背景對照和樣品
  • 分別移取xx微升 緩沖液(Reagent C到96孔板中的所有孔
  • 分別加入xx微升 酶促液Reagent D
  • 分別加入xx微升 反應液Reagent E
  • 分別加入xx微升 底物液(Reagent F
  • 輕輕搖動96孔板
  • 25℃溫度下孵育3分鐘
  • 分別加入xx微升 陰性液(Reagent G待測樣品(100微克蛋白)到相應孔(注意:樣品須清澈
  • 輕輕搖動96孔板
  • 即刻放進酶標儀檢測:0分鐘讀數和10分鐘讀數
  • 活性計算

 

 

 

注意事項

 

  • 本產品為20次操作,包括背景對照
  • 操作時,須戴手套
  • 系統操作過程中,背景測定只需1
  • 建議樣品忌用碳酸鹽處理
  • 加入樣品啟動反應后3秒內即刻光譜測定
  • 反應測定值由高到低變化;測定可以持續10分鐘
  • 測定值由高到低變化,即0分鐘測定讀數高于10分鐘測定讀數,表明有酶活性
  • 光譜測定后,比色皿須清洗*
  • 建議待測樣本蛋白濃度為100微克/50微升;如果樣本酶活性過低或過高,則可以增加或降低樣本量;注意計算公式的調整(本公司提供  Bradford蛋白質濃度定量試劑盒GMS30030.1)
  • 胱硫醚-β-合成酶活性單位濃度定義:在37溫度下,pH 8.0條件下,每分鐘內能夠氧化1微摩爾還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH所需的酶量作為一個活性單位
  • 本公司提供系列轉硫通路酶學技術產品

質量標準

 

  • 本產品經鑒定性能穩定
  • 本產品經鑒定檢測準確

免責聲明

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