溫育是ELISA測定為要害、簡單出現問題的步驟。為常見的溫育溫度有37℃和室溫，其次是43℃和2～8℃。目前國內售ELISA 試劑盒溫育時刻為37℃，30 min~1 h，進口ELISA試劑盒則一般為37℃，1～2 h 能有較*的結合。  
溫育時刻、溫度的挑選一般依據試劑盒的說明書挑選溫育的時刻、溫度。加完樣本和（或）試劑后將微孔板從室溫放入水浴箱或溫箱中時，孔內溫度從室溫升至37℃ 需求一定時刻，如果是將微孔板一放入溫箱即開端計時，這樣就簡單形成實際測定中溫育時刻不行，易致弱陽性標本測不出來。
操控辦法：
①如有兩種溫度，盡量使 用較低的溫育溫度、較長反響時刻的條件；
②用1個小溫度計放置在板孔反響液中丈量觀察。外周孔顯色較中心孔深的現象。發生的原因可能是為96 孔板周圍孔與中心孔在溫育中的熱力學梯度形成的，因此在溫育時盡量采用水浴。

孵育前加樣時刻過長，酶試劑加出孔外，運用滴瓶滴加試劑時，滴加的視點不同和揉捏的力度 不同，致使滴加的試劑量禁絕，都可導致實驗結果禁絕確。
操控辦法：
①實驗樣本過多時，可分批次操作，以削減實驗時刻延伸形成的差錯；
②加酶試劑后，用吸水 紙吸干孔外試劑；
③作定量實驗時，運用加樣器加注試劑，并常常校對其性，此外，要做到一份樣本一個移液頭，避免穿插污染。