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因為抗原在細胞染色時需先固定，所以，抗體與抗原的結合比在溶液中結合需要更長的時間。孵育的時間可以根據實驗設計進行相應調整，但是產生有效結合的時間一般須超過30min。通過增加二抗濃度可以縮短孵育時間。通常一些折衷辦法可使二者兼頤。產生強烈的信號往往伴有高背景的問題。低濃度試劑產生的背景雖較低，但信號的強度也相應較弱。一般推薦選擇相對較短的時間進行二抗的孵育（30～60min），并應對標記二抗進行滴度測定，使其產生較低背景并形成可接受的信號強度。總之，抗體應該用含高濃度非特異性蛋白的緩沖液稀釋。一般使用牛血清白蛋白（BSA）、胎牛血清（FBS）和脫脂奶粉，或者與標記抗體相同種屬的正常血清。
1．對照
特異性染色反應應與對照進行比較。地評價一種染色模式，應該比較來自相同種屬的兩種抗體。對多克隆抗體來說，的對照是制備特異性抗體的同一動物的免疫前采集的血清，但是，在多數情況下，相同種屬動物的非免疫血清也可以采用。對單克隆抗體而言，對照必需是和特異性抗體的來源相同，即細胞培養上清與上清對比，小鼠腹水與腹水對比，或者純化抗體與純化抗體相對應。如果可能，對照抗體應該是特異性抗體的同類或亞類。來自親代的骨髓瘤細胞培養上清是不適宜的對照，因其不含抗體。但來自美國典型培養收藏中心（theAmericantypeculturecollection，ATCC）的適當對照雜交瘤細胞系是有效的。此外，如果使用間接測定法，二級試劑亦應經過檢測。當使用酶標檢測法時，應該做未加任何抗體的酶反應對照，以證實某些內源性酶反應的存在與定位。
2．準備
對抗體的結合和觀察zui重要的準備工作是對一抗和二抗進行效價的測定。調整加入的一抗和二抗的用量，使之能得到有效強度的信號，而非特異染色較低。一般通過系列稀釋各種抗體來得到這種效果（通常用含蛋白的緩沖液如3％BSA／PBS），并在靶細胞株同時進行實驗觀察。1：3稀釋可以很快得出一個合理的結果。對各種一抗的準備，效價滴定試驗應該重復進行。而對二抗效價滴定后，就可以作為該抗體的使用標準。
3．需要的溶液和試劑
一抗、二抗（多數為商品來源）、PBS和3％／BSA／PBS。
4．操作步驟
（1）將組織切片或細胞涂片置于濕盒中。
（2）加入一抗，所有的稀釋必須用含蛋白的溶液。例如，含3％BSA的PBS。單抗一般是雜交瘤細胞培養上清（特異性抗體濃度一般用20～50ul／ml）。小鼠腹水，純化的單抗和多抗，粗制的多抗血清應該在特異性抗體濃度為0．1～long／m1稀釋范圍內檢測。如果特異抗體濃度是未知的，則將初始材料做1：10，1：100，1：1000，1：10 000稀釋。
（3）將標本片置濕盒中，室溫孵育至少30min。對某些抗原抗體反應，延長孵育時間至24h，可以增加其敏感性。
（4）用PBS洗滌，換液3次，每次>5min。此緩沖液可以補加1％TritonX-100或NP-40，有助于解決背景問題。
（5）加入標記的二抗。二抗必須用含有蛋白的溶液如3％／BSA／PBS或1％免疫球蛋白／PBS（來自檢測試劑的相同種屬）進行稀釋。常用的二級試劑包括酶或膠體金標記的抗免疫球蛋白抗體、蛋白A和蛋白G。
酶標試劑如果使用商品，檢測時二抗的稀釋范圍在1：50～1：1000。堿性磷酸酶標記的試劑應該用Tris緩沖液稀釋，不可用PBS。
金標試劑用PBS洗滌金溶膠顆粒。用含1％明膠的PBS稀釋后加至標本上。
（6）將加標記二抗的標本片放于濕盒中，在室溫至少孵育20min。對于金標試劑，應定期在顯微鏡下觀察直至獲得滿意信號。
（7）更換PBS，漂洗3次，每次5min。
至此，標本片即可用于檢測。
5．常見的問題
如果發現背景較深，常為非特異性結合所致，可以用含蛋白液體預先孵育標本而加以抑制。
一般使用的蛋白溶液是3％BSA，10％FBS（胎牛血清，因只含有低濃度的IgG），10％干奶粉或者來自與檢測試劑相同種屬的純抗體（1％）。阻斷蛋白可以加在各種抗體的準備階段，也可以在加入抗體前預先孵育標本。
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