免疫熒光標記實驗流程（IF）

免疫熒光單標記方法

免疫熒光單標記是指只標記一種蛋白質分子，方法比較簡單，只要按照染色步驟去做，通常不存在太多的問題。但要注意固定液的選擇，固定液選擇的合適與否，可能會直接影響染色結果。具體染色方法如下。

免疫熒光標記實驗流程（IF）

1、所需材料與試劑

a, 培養在蓋玻片或玻璃培養皿中融合程度達到60%-70%的細胞。

b, 一抗、FITC或TRITC標記的二抗。

c, 4%多聚甲醛固定液或冷丙酮固定液 (-20℃預冷20 min)。

d, 封閉液。

e, 0.01mol／LPBS緩沖液。

2、染色方法

a, 取出培養有細胞的蓋玻片或glass-bottom培養皿，用0.01MPBS洗2-3遍。

b, 加入0.3%的Tritonx-100, 37℃, 30 rain

c, 加入4%多聚甲醛試問固定30 min或冷丙酮4℃固定10 min。

d，正常阻斷血清1:20封閉試問20-30 min，抑制IgG的非特異性結合。阻斷血清必須選擇與二抗同一種屬的正常血清。

e, 去掉正常血清，直接加入一抗，37℃孵育1 h或4℃過夜。抗體以0.01 mo/LPBS稀釋(理想的抗體濃度需經試驗而定)。

f, 0.3% TritonX-100洗5 min，0.01 mol/IPBS洗5 min，0.3% TritonX 5 min，0.01 M PBS洗5 rain。

g, 加入FITC-二抗或TRITC-二抗，37℃，孵育1h。

h, 0.3%TritonX-100洗5rain，0.01 mol/LPBS洗5min，0.3% Triton X 5min，0.01mol/LPBS洗5 min，用濾紙吸干。

i, 90%甘油(PBS配制)封片。

j, 激光掃描共焦顯微鏡下觀察，或于4℃避光保存。

免疫熒光標記實驗流程（IF）

免疫熒光雙標記方法

免疫熒光的雙標記是指同時標記細胞內兩種蛋白質分子，當懷疑某種配體與已知受體結合后可用此方法加以證明。此方法稍微復雜一些，首先應注意所用的一抗必須是來自不同種屬動物的兩種特異性抗體(例如：A抗體為多克隆抗體，來自家兔；B抗體為單克隆抗體，來自小鼠)。其次，兩種二抗所帶熒光素的發射光不應重疊，且盡量遠離，通常可以選擇FITC和TRITC、Alex488和TRITC、FITC和Cy5，或Cy3和Cy5等來組合。通常情況下，染色時兩種一抗可以同時孵育，然后可以同時孵育兩種二抗。但當染色結果一種顏色非常弱，而另一種顏色比較強時，應考慮先孵育顏色較弱的二抗。其他步驟同免疫熒光單標記。

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