理性闡述qPCR實驗的Ct值的合理范圍。（附Ct值過大或過小的解決方法）

Ct值是什么？

Ct值具有什么樣的作用？

Ct值的正常范圍是多少？

Ct值太大或者太小的原因？

Ct值是熒光定量PCR重要的結果呈現形式。它被用于計算基因表達量差異或者基因拷貝數。那么熒光定量的Ct值多大可被認為是合理？如何保證Ct值的有效范圍呢？今天就讓小編來為大家解答這個問題。

Ct值是什么？

qPCR擴增過程中，擴增產物的熒光信號達到設定的熒光閾值時的所對應的擴增循環數（Cycle Threshold）。C代表Cycle，T代表Threshold。簡單講，Ct值就是qPCR中起始模板擴增達到一定產物量時，所對應的循環數。所謂“一定產物量”后續作進一步解釋。

Ct值有什么作用？

1.指數擴增、模板量與Ct值的關系

理想情況下，qPCR中的基因經過一定的循環數被指數擴增而積累，擴增循環數和產物量之間的關系是：擴增產物量=起始模板量×（1+En）循環個數。然而qPCR反應并不是一直處于理想情況下，當擴增產物量達到“一定產物量”時，此時循環個數為Ct值，處于指數擴增時期。Ct值與起始模板量的關系：模板的Ct值與該模板的錨點起始拷貝數的對數存在線性關系。起始模板量濃度越高，Ct值越小；起始模板量濃度越低，Ct值越大。

2.擴增曲線、熒光閾值與一定產物量

qPCR擴增產物量是以熒光信號的形式直接呈現，也就是擴增曲線。在PCR早期，擴增處于理想情況下，循環數較少，產物積累少，產生熒光的水平不能與熒光本底背景明顯地區別，之后熒光的產生增加進入指數期。可以在PCR反應剛處于指數期的某一點上來檢測PCR產物的量，以此作為“一定產物量”，并且由此來推斷模板初的含量。因此，一定產物量對應的熒光信號強度，也就是熒光閾值。

在PCR的后期，擴增曲線不再呈現指數擴增，進入線性期和平臺期。

3.Ct值的重現性

PCR循環在到達Ct值所在的循環數時，剛剛進入真正的指數擴增期，此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現性*，即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內擴增，得到的Ct值是恒定的。

Ct值的范圍？

1.擴增效率E_n

PCR擴增效率是指聚合酶把待擴增基因轉變生成擴增子的效率。由1個DNA分子轉變生成2個DNA分子時的擴增效率為100%。擴增效率常用E_n表示。為了方便后續文章的分析，簡要介紹下影響擴增效率的因素。

2.Ct值的范圍

Ct值的范圍為15-35。Ct值小于15，認為擴增在基線期范圍內，未達到熒光閾值。理想情況下，Ct值與模板起始拷貝數的對數存在線性關系，也就是標準曲線。通過標準曲線，擴增效率為100%時，計算出基因單個拷貝數定量的Ct值在35左右，若大于35，理論上模板起始拷貝數小于1，可認為無意義。

對于不同的基因Ct范圍，因起始模板量中基因拷貝數和擴增效率不同，需做出該基因的標準曲線，計算出基因的線性檢測范圍。

3.Ct值的影響因素

由擴增循環數和產物量之間的關系：擴增產物量=起始模板量×（1+E_n）循環個數，可以看出，在理想條件下，起始模板量和E_n會對Ct值產生影響。模板質量或者擴增效率的差異會造成Ct值偏大或過小。

4.Ct值過大或過小

小翊威逼利誘了我公司技術部的牛牛們，總結出Ct值常見的兩類問題的原因和解決方法，以饗讀者。