器材與試劑：
干粉型培養(yǎng)基、胰蛋白酶，青霉素、鏈霉素 . 純凈水系統(tǒng)、電子天平、 PH 計(jì)、磁力攪拌器。

具體步驟：

一 . 水的制備： 

細(xì)胞培養(yǎng)用水必須非常純凈，不含有離子和其他的雜質(zhì)。需要用新鮮的雙蒸水、三蒸水或純凈水。

二 .PBS 的制備與消毒 ( 也可用于其它 BSS ，如： Hanks ， D-Hanks 液的配制 ) ：

1. 溶解定容：將藥品（ NaCl 8.0g ， KCl 0.2g ， Na2HPO4·H2O 1.56g ， KH2PO40. 2g ）倒入盛有雙蒸水的燒杯中，玻璃棒攪動(dòng)，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中準(zhǔn)確定容至 1000ml ，搖勻即成新配制的 PBS 溶液。 

2. 移入溶液瓶?jī)?nèi)待消毒：將 PBS 倒入溶液瓶（大的吊針瓶）內(nèi)，蓋上膠帽，并插上針頭放入高壓鍋內(nèi) 8 磅 消毒 20 分鐘。注意高壓消毒后要用滅菌蒸餾水補(bǔ)充蒸發(fā)掉的水份。

三 . 胰蛋白酶溶液的配制與消毒： 

胰蛋白酶的作用是使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解從而使細(xì)胞離散。不同的組織或者細(xì)胞對(duì)胰酶的作用反應(yīng)不一樣。胰酶分散細(xì)胞的活性還與其濃度、溫度和作用時(shí)間有關(guān)，在 pH 為 8.0 、溫度為 37℃ 時(shí)，胰酶溶液的作用能力。使用胰酶時(shí)，應(yīng)把握好濃度、溫度和時(shí)間，以免消化過(guò)度造成細(xì)胞損傷。因 Ca2+ 、 Mg2+ 和血清、蛋白質(zhì)克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液時(shí)應(yīng)選用不含 Ca2+ 、 Mg2+ 的 BSS ，如： D-Hanks 液。終止消化時(shí)，可用含有血清培養(yǎng)液或者胰酶抑制劑終止胰酶對(duì)細(xì)胞的作用。 

1. 稱(chēng)取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液濃度為 0.25 ％，用電子天平準(zhǔn)確稱(chēng)取粉劑溶入小燒杯中的雙蒸水（若用雙蒸水需要調(diào) PH 到 7.2 左右）或 PBS （ D-hanks ）液中。攪拌混勻，置于 4℃ 內(nèi)過(guò)夜。 

2. 用注射濾器抽濾消毒：配好的胰酶溶液要在超凈臺(tái)內(nèi)用注射濾器（ 0.22 微米微孔濾膜）抽濾除菌。然后分裝成小瓶于 -20℃ 保存以備使用。

四 . 抗生素溶液的配制

1. 所用純凈水（雙蒸水）需要 15 磅 高壓 20 分鐘滅菌。 

2. 具體操作均在超凈臺(tái)內(nèi)完成。青霉素是 80 萬(wàn)單位 / 瓶，用注射器加 4ml 滅菌雙蒸水。鏈霉素是 100 萬(wàn)單位 / 瓶，加 5ml 滅菌雙蒸水，即每毫升各為 20 萬(wàn)單位。 

3. 使用時(shí)溶入培養(yǎng)液中，使青鏈霉素的濃度終為 100 單位 /ml 。 1 單位＝ 1 微克？

4. 細(xì)胞庫(kù)之細(xì)胞培養(yǎng)基不加抗生素

5.培養(yǎng)自ATC引進(jìn)之細(xì)胞株，培養(yǎng)基中不加抗生素。

6. 培養(yǎng)自其它實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)之細(xì)胞株，制作token freeze 前培養(yǎng)基須添加抗生素，待token freeze 通 過(guò)污染測(cè)試后，大量培養(yǎng)時(shí)則不加抗生素。

7. 寄送活細(xì)胞時(shí)，須將培養(yǎng)液充滿整個(gè) flask 時(shí)，則須添加抗生素 。 (penicillin 100 units/ml +streptomycin 100 ug/ml) 

8. 若要檢測(cè)mycoplasma，則培養(yǎng)基內(nèi)不可添加gentamicin，因gentamicin 會(huì)抑制 mycoplasma 生長(zhǎng)。

9. 去除細(xì)菌污染之抗生素混合配方 : penicillin 250 units/ml, streptomycin 250 ug/ml, neomycin 250 ug/ml, bacitracin 2.5 units/ml 
注意混合使用后藥物毒性會(huì)增強(qiáng)。

10. 抗生素使用種類(lèi)與濃度：

工作濃度. 儲(chǔ)存溫度. 殺滅細(xì)菌 
penicillin 100 units/ml             -20℃ G(+) bacteria 
streptomycin 100 ug/ml       -20℃ G(+) and G(-) bacteria 
chlotetracycline 50 ug/ml           -20℃ G(+) and G(-) bacteria 
gentamicin 50 ug/ml       -20℃ G(+) and G(-) bacteria, mycoplasma 
amphotericin B 2.5 ug/ml            -20℃ yeast and molds 
nystatin 50 ug/ml        -20℃ yeast and molds 
fungizone 2.5ug/ml         -20℃ yeast and molds