ELISA試劑盒應嚴厲遵循規則操作，必能得出的成果。首先應選取的試劑，杰出的儀器和正確的操作是確保ELISA檢測成果牢靠的必要條件。所以ELISA試劑盒的購買，試劑質量的確保以及試驗前試驗儀器的查看都是很重要的。
 一、標本的采集及保存
1、血清：全血標本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或將標本放于-20℃或-80℃保存，但應防止反復凍融。
2、血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標本采集后30分鐘內于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，或將標本放于-20℃或-80℃保存，但應防止反復凍融。
二、試劑的預備 
按試劑盒說明書的要求預備試驗中需用的試劑. ELISA頂用的蒸餾水或去離子水,包含用于洗刷的,應為新鮮的和高質量的.自配的緩沖液應用pH計丈量較正.從冰箱中取出的試 驗用試劑應待溫度與室溫平衡后運用.試劑盒中本次試驗不需用的部分應及時放回冰箱保存。
三、加樣：別離設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、規范孔、待測樣品孔。在酶標包被板上規范品加樣50μl，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品zui終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，悄悄晃動混勻。
四、溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。
五、洗刷：當心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗刷液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。
六、顯色：每孔先參加顯色劑A50μl，再參加顯色劑B50μl，悄悄震動混勻，37℃避光顯色15分鐘.
七、測定：以空白空調零，450nm波長依序丈量各孔的吸光度（OD值）。 測定應在加終止液后15分鐘以內進行。