【愛必信實驗小貼士】免疫組織化學

一、定義：

細胞化學，是指帶顯色劑標記的特異性抗體在組織細胞原位通過抗原抗體反應和組織化學的呈色反應，對相應抗原進行定性、定位、定量測定的一項新技術。

二、分類：

根據染色在整個制片中的位置分為：包埋前染色、包埋后染色；

根據標記物種類分為：免疫熒光法、免疫過氧化物酶法、免疫鐵蛋白法、免疫膠體金法；

按標記物的位置分為：

    直接法：標記物結合在直接與組織抗原發生免疫結合的特異性抗體，即抗體上；

    間接法：標記物通過其所標記的非特異抗體，即第二抗體間接地與抗體結合；

    標記物——抗體復合法。

三、原理：

免疫組化染色是引入附有標記物的外源性抗體（或抗原），使之錨定于組織或細胞標本中相應的抗原（或抗體）部位，標記物經呈色反應而顯示待檢抗原（或抗體）。

四、主要過程：

1、脫蠟水化：

切片在脫蠟前，放在APES（防止脫片用的，缺點是有低毒性） 1：50 丙酮溶液中浸泡3分鐘，晾干或60°C恒溫箱中烘烤20分鐘，然后將組織切片置于二甲苯中浸泡10min，更換二甲苯再浸泡10min，無水乙醇浸泡 10min，更換無水乙醇再浸泡10min，然后依次95%乙醇，70%乙醇，50%的乙醇各5min，后用蒸餾水浸泡 5min；

2、清洗：先用蒸餾水溫柔的沖洗一會，更換PBS沖洗5min，再用PBS沖洗5min；

3、抗原修復：

（1）微波爐加熱：適用于來源于人、大鼠、小鼠的組織標本；來源于其他動物種屬的組織標本；

（2）高壓熱修復：適用于較難檢測或核抗原的抗原修復；

（3）酶消化方法：適用于被固定遮蔽的抗原：包括 Collagen.GFAP. Complement. Cytokeratin.c-erB-2.LCA.LN.等。

4、封閉：用和二抗來源一致的血清在保濕盒中于37℃孵育15-30min，然后甩去封閉用血清；

5、一抗孵育：

滴加適當比例稀釋的一抗，將切片放在保濕盒中于4℃冰箱中過夜孵育或者溫箱37℃孵育1-2個小時。

6、清洗：過夜后的切片用PBS沖洗2，沖洗3次；

7、二抗孵育：

滴加標記二抗在保濕盒中于37℃孵育30分鐘。

8、清洗：切片用PBS沖洗2min，沖洗3次；

9、顯色：加入顯色劑顯色，根據顯微鏡下的觀察決定終止顯色的時間一般都在3-10min左右，常用5min。

10、沖洗：充分沖洗10-15min,

11、復染

12、脫水透明

依次用50%， 70%， 95%酒精各5min浸泡切片，后用100%酒精浸泡10min，更換酒精浸泡10min，后用二甲苯浸泡10分鐘，更換二甲苯，再浸泡10min；

13、封片

撈出，用樹脂封片，一滴/張,在其上蓋上小玻片封好的組織切片，放入超凈臺中，打開抽風，沖一段時間，后把切片放在窗臺上涼2-3天。

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