一、實驗?zāi)康呐c原理

蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中電泳時，它的遷移取決于它所帶電荷以及分子大小和形狀等因素。1967年Shapiro等人發(fā)現(xiàn)，如果在聚丙烯酰胺系統(tǒng)中加入陰離子去污劑十二烷基磺酸鈉（SDS），大多數(shù)蛋白質(zhì)能與SDS按一定比例結(jié)合，即每克蛋白質(zhì)結(jié)合1.4g的SDS－復(fù)合物都帶上相同密度的負電荷，它的量大大超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，因而消除了蛋白質(zhì)原有的電荷差別，使蛋白質(zhì)分子電泳的遷移率主要取決于本身的分子量，而與蛋白質(zhì)所帶的電荷無關(guān)，在一定條件下，蛋白質(zhì)的分子量的對數(shù)與電泳遷移率間呈負相關(guān)。

本實驗的目的是對多酚氧化酶的純化度鑒定及分子量的測定，通過實驗，學(xué)習(xí)和掌握SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法蛋白質(zhì)純度和分子量的鑒定。

二、儀器與試劑

1、材料：

硫酸銨鹽析沉淀的多酚氧化酶粗酶樣品、DEAE-纖維素DE52柱層析的樣品，Sephadex G-100柱層析的樣品。

2、試劑：

（1）丙稀酰胺（Acr母液）：30%Acr （Acr/Bis）

（2）10%的SDS溶液

（3）10%的過硫酸銨溶液

（4）四甲基乙二胺（TEMED）

（5）分離膠緩沖液：1.5M Tris，PH8.8

（6）濃縮膠緩沖液：1.0M Tris，PH6.8

（7）電極緩沖液：10×30g Tris，125g 甘氨酸和5g SDS，加水溶解定容至1000ml，pH8.3

（8）樣品緩沖液：0.2M Tris，PH6.8，1%SDS，30%甘油，巰基乙醇及溴酚蘭

（9）染色液：0.15%考馬斯亮藍R250，溶于脫色液

（10）脫色液：50%的甲醇，7%的冰醋酸的水溶液

（11）標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白。

3、儀器設(shè)備：

電泳儀、垂直電泳槽等。

三、操作步驟

1、凝膠制備：

用兩塊電泳玻璃板制成垂直板槽（不能漏膠），垂直放置。將配制好的分離膠溶液倒入，滴加入無離子水，待凝膠聚集后，倒出無離子水，用吸水紙吸干，倒入濃縮膠，再插入梳子。

2、上樣：

分別取樣品若干ml于離心管中，按1/1～1/5比例加入5×樣品緩沖液，再沸水浴中加熱3～5min，取出待用。用微量注射器分別吸取不超過 30μl不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣品和試驗樣品注入樣品槽。點樣結(jié)束后，調(diào)節(jié)電泳儀電流到10mA（2～3mA/em），保持電流穩(wěn)定不變，當(dāng)溴酚藍遷移到離分離膠底1～2cm時，即可停止電泳。

3、染色：

電泳完畢后，取出凝膠板，浸入染色液中，在37℃溫箱中保溫過夜。倒掉染色液，24h后，即可看到清晰的蛋白質(zhì)條帶。

四、結(jié)果 （略）

五、注意事項

1、SDS與蛋白質(zhì)的結(jié)合按質(zhì)量成比例（即：1.4gSDS/g蛋白質(zhì)），如果比例不當(dāng)，就不能得到準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)。

2、用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定蛋白質(zhì)相對分子量時，必須同時作標(biāo)準(zhǔn)曲線。不能利用這次的標(biāo)準(zhǔn)曲線作為下次用。

3、有些蛋白質(zhì)由亞基（如血紅蛋白）或兩條以上肽鏈（α-胰凝乳蛋白酶）組成的，它們在巰基乙醇和SDS的作用下解離成亞基或多條單肽鏈。因此，對于這一類蛋白質(zhì)，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定的只是它們的亞基或是單條肽鏈的相對分子量。

4、有的蛋白質(zhì)（如：電荷異?；蚪Y(jié)構(gòu)異常的蛋白質(zhì)；帶有較大輔基的蛋白質(zhì)）不能采用該法測相對分子量。

5、如果該電泳中出現(xiàn)拖尾、染色帶的背景不清晰等現(xiàn)象，可能是SDS不純引起。