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反相色譜法以被測的高分子為固定相、以惰性氣體為流動相，為了測定需要，在流動相中加入一些探針分子，它們是揮發(fā)性的低分子。將探針分子注入氣化室氣化后，由載氣帶入色譜柱，測定它們在兩相中的分配，從而研究高分產(chǎn)的各種性質(zhì)，高分子與探針分子的相互作用以及高分子與高分子間的相互作用。
反相色譜是迄今在液相色譜中應(yīng)用廣泛的技術(shù)，主要是因為它適用于分析極大多數(shù)的非極性物質(zhì)和很多的可離子化的及離子化合物。大多數(shù)用于反相色譜的固定相本質(zhì)上都是疏水物質(zhì)，因此，分析物是按照它們與固定相的疏水相互作用的大小程度來分離的，樣品基體中其它疏水雜質(zhì)組分也能以同樣的方式保留。
在反相色譜法中的固定相是被共價結(jié)合到硅膠載體上的直往飽和烷烴，其鏈的長短不同，長的是十八烷基、這也是使用得多的固定相、流動相的極性比固定相的極性強。在反相鍵合相色譜中，極性大的組分先流出、性小的組分后流出。一般說來，固定相上的烷基配合基或被分離分子中非極性部分的表面積越大，或者流動相表面張力及介電常數(shù)越大，則締合作用越強，保留值越大。
反相色譜的影響因素：
1、溶質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)（極性）
極性越弱，疏水性越強，k越大，tR也越大。同系物碳數(shù)越多，極性越弱，k越大；引入極性取代基，降低疏水性，k值變小。
2、固定相
鍵合烷基的疏水性隨碳鏈的延長而增加，溶質(zhì)的k也增大。硅膠表面鍵合烷基的濃度越大，則溶質(zhì)的k越大。
3、流動相
極性越強，洗脫能力越弱，使溶質(zhì)的k越大；溶劑種類：水為弱溶劑，醇為強溶劑；溶劑比例：水的比例增加，使k增大。
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