實驗方法原理    首先建立家兔椎間盤細胞的體外培養系統，其中，組給予純氧，另外3組給予不同濃度的臭氧：30 μg/ml，60 μg/ml和80 μg/ml，然后于15 min及30 min后，采用臺盼藍細胞排斥試驗計算椎間盤細胞的活細胞率。
實驗材料    
家兔

試劑、試劑盒    
培養液DMEMHanks’緩沖液胎牛血清胰島素轉鐵蛋白鹽青霉素鏈霉素

儀器、耗材    
培養皿培養瓶燒瓶試管眼科剪、眼科鑷CO2 培養箱pH 計恒溫水浴

實驗步驟    
一、實驗步驟

1.  組織塊貼塊法

（1）取材：空氣栓塞法處死家兔后，在無菌狀態下獲取家兔椎間盤組織。置于準備好的DMEM 培養基(含雙抗)。迅速帶回到無菌超凈臺上。

（2）剪切：在超凈臺上，進一步將周圍組織分離，用Hanks’液沖洗數遍，直到沖洗液透明為止。眼 科剪刀將組織修剪為1~2 cm3 大小的小組織塊，Hanks’沖洗干凈。加入少量含血清的培養液。(組織塊不宜過小，否則不容易爬出足夠數量的細胞)。

（3）接種：用吸管吸取小組織塊入培養瓶底部，擺放均勻，一個25 cm2 的培養瓶可放置10-15 個小組織塊，翻轉培養瓶，加入少量培養液。4~6 小時后，待組織塊充分貼壁后，再翻轉回來(動作一定要輕巧， 以免剛剛貼壁的組織塊脫離瓶底)。

（4）于5% CO2 孵箱中培養，每隔 3 天換液。待細胞 95%融合時，0.25%胰蛋白酶傳代分瓶。

2.  酶消化法

（1）前面步驟同組織塊貼塊法 1、2。

（2）組織塊再進一步剪切，此時培養液中不加血清。

（3）完畢后，加入消化液，移入到10  ml 離心管，培養箱內消化。

（4）每隔20 分鐘，用吸管吹打一次，觀察液體有否變渾濁，并取少量液體，在相差倒置顯微鏡下觀察。

（5）0.4%臺盼蘭染色計算活細胞數目。

（6）接種密度在105 數量級。置于5%CO2 孵箱中培養，每隔 3 天換液。

（7）待細胞 95%融合時，0.25%胰蛋白酶傳代分瓶。

二、結果

IVD 細胞為類軟骨細胞，描述：單層細胞形狀不規則，可呈三角形、多角形，梭形及不規則形。不同于成纖維細胞。如下圖：

圖1：組織塊貼塊法
 

圖2：傳代細胞形態
 

收起 
注意事項    
 椎間盤位于相鄰兩個椎體之間，取材過程較為繁瑣， 要求動作迅速，爭取在家兔死后半小時內完成，否則，該組織對缺氧耐受性差導致培養失敗。