實驗方法原理    SD胎鼠腦皮層神經元體外培養7 d ，微量移液器塑料滴頭于培養孔內機械性劃割培養之神經元，依劃割程度不同分為輕、中、重3組，對照組除不進行機械性劃割，其余處理同損傷組，傷后不同時間點（10，30 min ， 1，3，6，12，24 h）檢測細胞存活率及培養液上清乳酸脫氫酶(LDH)含量。
實驗材料    SD大鼠
試劑、試劑盒    硼酸硼砂緩沖液胰酶-EDTA 消化液D-Hanks’
儀器、耗材    眼科剪滴管離心機培養皿 CO2培養箱
實驗步驟    
一、實驗步驟
 
1. 孕16 d SD 大鼠經麻醉后，碘酒、75%乙醇消毒腹部皮膚，依次剪開皮膚、肌肉、皮下筋膜，無菌操作下取出胚胎放入預冷的D-Hanks’平衡鹽液中。
 
2. 在解剖顯微鏡下分離并取出胚胎大腦皮層，除去腦膜，剪碎組織成約1mm3 大小，加入胰酶-EDTA 消化液并放入 37℃孵箱內消化20 min，中間搖晃一次。
 
3. 隨后用滴管吸出組織轉移到裝有預冷的培養液(DMEM＋10%FBS)的離心管內終止消化液作用5 min。
 
4. 用滴管吸出組織轉移到裝有預冷的 DMEM＋10%FBS 的離心管內，用火焰拋光的巴斯德滴管吹打數次，靜置后取上清吸到另一支離心管內。重復上述步驟 2～3 次。
 
5. 將所收集的上清經200 目篩網過濾。
 
6. 過濾后的細胞懸液于800 rpm 離心5 min，棄上清，管內加入新鮮培養液(DMEM＋20%FBS)并吹打 成單細胞懸液。
 
7. 細胞計數，調整細胞密度按1.5x105/cm2  種入6 孔板內，放入CO2 孵箱中培養。培養48 h 后換液并 加入Ara-C使其終濃度為 1x10-5 mM/L。Ara-C作用24 h 后全量換液。以后每隔 3 天半量換液一次。
收起 
注意事項    
1. 上面的步驟是傳統方法。有許多地方可以進行改動：如消化時可以直接用0.125-0.25%的胰酶消 化15-20 min 左右，也可用 DNA 酶進行消化，有人還直接進行吹打，都可行。
 
2. 上面雖然時大鼠皮層神經元，但是同樣適用于小鼠，但是應該選擇孕13 d 左右的小鼠。
 
3. 神經元是一種比較難培養的細胞，因此在接種時細胞的密度一定要夠。
 
4. 在玻片上培養神經元時，一定要注意玻片的來源和處理方法，這個非常重要，對神經細胞的影響 是很大的。如果您現在在玻片上培養的神經元生長情況還不錯的話，那么您在以后的培養中還是用同 一來源(廠家)的玻片。
 
5. 如果有B27 和neurobasal 培養基，那么就方便了(不用加 AraC):
 
(1)把細胞懸液用(DMEM＋20%FBS)懸浮，種到培養皿上6－12 h 后，全量換成 2% B27 的 neurobasal 培養基，繼續培養，3 d 半量換液。
 
(2)把細胞懸液用直接用 2% B27 的 neurobasal 培養基懸浮接種。
 
(3)可以用新生1 d 內的胎鼠皮層直接培養。
酶消化法
實驗材料    小鼠
試劑、試劑盒    酒精解剖液胰蛋白酶DMEM F12B27阿糖胞苷培養液
儀器、耗材    培養箱
實驗步驟    
一、小鼠大腦皮層神經元原代培養步驟

1.  于無菌條件下切取鼠頭并以75%酒精浸泡1 min，解剖出完整鼠腦。

2.  預冷解剖液中分離去除軟膜、血管、取大腦皮質漂洗，用眼科剪將皮質反復剪切成碎塊。

3.  移入培養皿中，吸除解剖液加入0.25%胰蛋白酶2 ml，37℃培養箱中消化30 min。

4.  將皮層組織碎塊移入離心管，棄去剩余消化液，用接種液洗3次，每次洗滌后使組織塊充分沉降到試管底，棄去上清液。

5.  后再用接種液1 ml混懸，反復吹打（巴氏吸管）混懸液中組織塊，力度適中，至渾濁后將上清液移入培養瓶待用。

6.  加入1ml接種液后再次吹打，如此反復3-4次，組織塊逐漸消化后，棄去終殘塊。

7.  收集含單細胞懸液的上清液約4-5 ml于培養瓶中，以接種液重新懸浮細胞，細胞記數；接種1x107個細胞于6孔培養板中。

8.  培養24 h至細胞貼壁后，換全培養液（DMEM/F12+2%B27）培養3d，觀察神經元生長狀況。

9.  換用阿糖胞苷培養液、  每隔3d換全培養液1次，每次換半液。

二、神經元免疫化學鑒定

1.  4%多聚甲醛固定細胞30 min，PBS洗滌3次。

2.  加入無水甲醇:30%雙氧水（5:1）處理30 min，PBS洗滌3次。

3.  加入5%羊血清封閉20 min，棄去多余液體。

4.  加入Rabbit Anti-NSE（1:100）（神經元特異性烯醇化酶），培養箱中孵育2-4 h，PBS洗滌3次。

6.  加入DAPI染液（1:40），室溫放置5-10 min；PBS洗滌3次。

7.  熒光顯微鏡觀察。 

三、結果      

圖1： 剛接種時細胞圖

圖2： 剛接種時細胞圖培養1d后

圖3： 剛接種時細胞圖培養2d后

圖4： 剛接種時細胞圖培養3d后

圖5： 剛接種時細胞圖培養4d后

圖6： 剛接種時細胞圖培養5d后

圖7： 剛接種時細胞圖培養6d后

圖8：第7d免疫鑒定圖