【產品名稱】

通用名稱：豬細小病毒PCR檢測試劑盒

英文名稱：Porcine pamovirus PCR Detection Kit

【包裝規格】 25T/盒 & 50T/盒

【預期用途】

本試劑盒適用于豬細小病毒檢測，不進行病毒分型，對豬細小病毒引起的流感及其并發癥的診斷及療效評估有重要指導意義。

【檢驗原理】

利用試劑盒提取DNA，在TaqDNA聚合酶的作用下，經高溫變性、低溫退火、中溫延伸的循環，使特異DNA片段的拷貝數放大一倍。經過35次循環，終使擴增DNA段放大了數百萬倍。將擴增DNA段進行電泳，經染色后，在紫外燈照射下，肉眼可見到DNA片段的擴增帶。

【主要組成成份】

注：陰性對照為豬基因組DNA，陽性對照為PPV經滅活處理的核酸提取物。

【儲存條件及有效期】-20℃以下保存，避免反復凍融，有效期12個月。

【需自備的物品】

PCR擴增儀、電泳儀、電泳槽、紫外凝膠成像儀、可調移液器、瓊脂糖等相關試劑及設備。

【注意事項】

1.病毒具有很強的感染能力，操作前必須準備好各種防御措施。

2.操作時須嚴格按照步驟進行，廢物必須放入含消毒液的廢物缸，以免污染實驗室和工作人員。

3.為避免其他核酸的污染而出現假陽性，必須使用不含DNA和RNA的離心管、吸管、槍頭、試劑和手套，操作人員須戴口罩。

【實驗準備】

如果是提取病毒RNA，請選用RNase free Tip槍頭和1.5 ml離心管或將槍頭和離心管用0.1% DEPC水處理后再使用。

【操作步驟】

1.樣品處理：每份樣品分別處理。

（1）新鮮采集的咽拭子、鼻拭子和糞便標本，并使用滅菌生理鹽水懸浮。

（2）標本收集后若不能立即檢測，可置于2～8℃冷藏過夜保存；如需長期保存，標本應凍存于-20℃～-80℃。

（3）標本保存期間應避免反復凍融。

2. 提取過程：

用QIAGEN、Roche公司DNA提取試劑盒提取DNA，具體操作按照其試劑盒說明書操作。

3. PCR擴增

（1）每份總體積20 µL，含15 µL PCR反應液（用前混勻），3µL 混合酶液，2 µL模板DNA。

例如：n份樣品，配制n+1份，15×（n+1）PCR反應液， 3×（n+1）混合酶液勻后取18 µL分裝成n份，分別加入2 µL模板DNA，作好標記。

（2）在PCR擴增儀上進行以下程序： 94 ℃ 3 min；循環94℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35次；再72 ℃延伸7 min。

4. 電泳

稱1.5 g瓊脂糖放于500 mL錐形瓶中，加入1倍TAE電泳緩沖液100 mL（取2 mL 50倍TAE電泳緩沖液，用雙蒸水稀釋至100 mL），于微波爐中熔解，待冷卻至50℃左右再加入50 µL染色液（自備）混勻。在電泳槽內放好梳子，倒入瓊脂糖凝膠，待凝固后將PCR擴增產物中加入4µL上樣緩沖液（自備）混勻后取10 µL點樣于瓊脂糖凝膠孔中，以110～120V電壓于1倍TAE電泳緩沖液中電泳，紫外燈下觀察結果。（注：染色液是2000×，上樣緩沖液是6×）

【結果判定】

陽性對照出現177 bp擴增帶、陰性對照無帶出現（引物帶除外）時，實驗結果成立。被檢樣品出現177 bp擴增帶為豬細小病毒陽性，否則為陰性。