樣本來源   

對于IHC，組織是來自患者或動物，經過冷凍或石蠟包埋。然后切成約4μm厚的切片。對于ICC，大部分細胞外基質被去除，只剩下整個細胞來染色，來源可以是細胞懸液，或組織培養細胞系。然而IHC遠遠不止于把抗體放在組織切片上、然后用顯微鏡觀察那么簡單。要想得到實用、可靠而清晰的結果，就需要耐心的對每一步進行優化。

根據標記物的不同分為免疫熒光法和免疫酶法，R&DSystems的網站列出了IHC/ICC實驗設計和優化的變量及影響因素如下：

1、樣本類型：組織或細胞

2、樣本制備：組織（石蠟或冰凍），細胞：（貼壁細胞或細胞懸液）

3、適當對照：無一抗，組織類型。

4、固定方法：灌注或浸泡。

5、固定劑：甲醛，醇類，丙酮。

6、封閉液：正常血清，牛血清蛋白（BSA）或脫脂奶粉。

7、抗原修復：蛋白酶，加熱。

8、檢測方法：直接或間接

9、一抗：物種

10、二抗：物種

11、標記物：熒光或酶（顯色）

12、復染劑：蘇木精或DAPI（熒光）

13、封片劑：抗淬滅或水性

14、顯微鏡觀察：熒顯微鏡或光學顯微鏡

處理不同樣本的區別 

ICC需要透化，要么通過固定過程，要么是單獨的透化步驟，而IHC可能不需要單獨的透化步驟，這取決于切片的厚度和固定方法。包埋在石蠟中的組織樣本在抗體染色前需要進一步處理。一旦處理好樣品，IHC和ICC的染色操作就幾乎沒什么差異了。

樣本固定和制備

1、組織石蠟包埋前的組織固定：4%甲醛固定劑是組織灌注和浸潤固定的常用溶液，一般需要4–24h，能很好地保留組織形態，切片機切片，貼附于載玻片干燥，石蠟切片存儲室溫多年，后續進行IHC/ICC之前需要再水化，需要抗原修復。

2、培養細胞固定：2%甲醛室溫固定20min，細胞樣本貼附載玻片，對于貼壁細胞直接放在6孔或24孔底部的無菌載玻片上生長，懸浮細胞可通過與包被多聚賴氨酸的載玻片孵育10min而附著在載玻片上。

3、冰凍組織切片固定：切片后用醇類固定，用于檢測磷酸化依賴的表位，在低溫箱進行樣本切片，冰凍切片存儲–80℃多達一年。通常保留酶的活性和抗原功能，不需要抗原修復，冰晶的形成可能負面影響組織結構。