如何完成一次又經濟的Tunel檢測？

——Yeasen TUNEL detection Kit 讓“美”原位呈現

通過TdT轉移酶將Fluorescein-dUTP結合到有缺口的DNA上是檢測細胞凋亡的常用方法之一，如Roche提供的In Situ Cell Death Kit正是基于這個原理。產品中的TdT轉移酶活性直接影響到標記的效率。翊圣生物立足于酶制劑生產，力求開發以酶制劑為基礎的產品，推出三款熒光素（Alexa Fluor 640，Alexa Fluor 488，FITC）標記的Tunel檢測試劑，在滿足客戶對產品高品質要求的同時又可以享受低至Roche一半的價格。

目前已經有超過120個課題組正在使用該產品，并在雜志上發表多篇英文文章，如Theranostics和EMBO Molecular Medicine等。

檢測機理：

細胞凋亡晚期，染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂產生大量的粘性3-OH末端，在脫氧核糖核苷酸末端轉移（TdT）的作用下，將熒光素/酶標記的dUTP結合到DNA的3-末端，從而可通過檢測熒光完成對細胞凋亡的檢測，這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法（Terminal-Deoxynucleotidyl Transferase Mediated Nick End Labeling,TUNEL），原理見圖1。

圖1：脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記（TUNEL）原理圖

產品特點:

適用范圍廣：可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養的細胞和從組織中分離的細胞。

檢測靈敏度高：可檢測出極少量的凋亡細胞。

背景干擾小：信噪比高。

觀察多樣性：熒光顯微鏡觀察，流式檢測。

數據展示：

1、小鼠前脂肪細胞（3T3-L）Tunel檢測

圖2：小鼠前脂肪細胞3T3-L凋亡檢測。行代表陰性對照，第二行代表陽性對照。

檢測試劑：Cat No. 40306 TUNEL Apoptosis Detection Kit (FITC)

2、石蠟切片樣本的Tunel檢測

圖3：在皮下移植瘤模型中，單獨使用LY3009120或聯合使用Vemurafenib和Obatoclax可以有效延緩甲狀腺癌[5]。IF=8.8

樣本類型：石蠟包埋的腫瘤組織（取自裸鼠）。檢測試劑：Cat No. 40307 TUNEL Apoptosis Detection Kit (Alexa Fluor 488)。

3、細胞爬片的Tunel檢測

圖4：硫酸鋅對不同分組的內皮細胞凋亡的影響^[11] 

樣本類型：HUVEC（人臍靜脈內皮細胞）。檢測試劑：Cat No. 40308 TUNEL Apoptosis Detection Kit (Alexa Fluor 640)

4、流式細胞術檢測細胞凋亡

圖5：PA處理可以有效降低重編程（reprogramming）過程中凋亡的發生^[9]。IF=3.7

樣本類型：iPS Cells。檢測試劑：Cat No. 40307 TUNEL Apoptosis Detection Kit (Alexa Fluor 488)。

文獻引用：

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 [15] Liu Q, Qian Y, Li P, et al. 131 I-labeled copper sulfide-loaded microspheres to treat hepatic tumors via hepatic artery embolization[J]. Theranostics, 2018, 8(3): 785.(IF 8.12 )

常見問題：

Q:出現非特異性熒光標記？

1）組織/細胞本身核酶或聚合酶活性水平較高，易導致出現非特異性的熒光標記，例如平滑肌細胞。解決方法是，取細胞或組織后立即固定并且要充分固定，以阻止這些酶導致假陽性。

2）使用了不適當的固定液，例如一些酸性固定液，導致出現假陽性。建議采用新鮮配置的4%中性對聚甲醛固定液。

3）TUNEL檢測反應時間過長，細胞或組織表面不能保持濕潤，也可能出現非特異性熒光。注意控制反應時間，并確保TUNEL檢測反應液能很好地覆蓋樣品。

Q:熒光背景很高？

1）高速分裂和增殖的細胞，轉錄水平高，有時也會出現細胞核中的DNA斷裂。

2）在激發光下長時間的暴露，導致假陽性的出現。

Q:標記效率低？

1）使用乙醇或甲醇固定會導致標記的效率較低。

2）固定時間過長，導致交聯程度過高。此時宜減少固定時間。

3）組織切片過厚，使得固定效果不理想，控制在10 μm以內。

4）熒光淬滅。Fluorescence在普通光照10min就會嚴重淬滅。解決方法是需注意避光操作。

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